3．Maleinmide法 上述酶標(biāo)抗體（IgG)的分子量較大，對抗體的穿透性有一定影響，而在制備過程中，需經(jīng)兩次純化，即多聚體與單體及單體與非標(biāo)記抗體的分離。已知單體（1個HRP分子標(biāo)記1個IgG分子)的分子量為190～200kD，非標(biāo)記抗體為146～150kD，用凝膠過濾法很難將二者分開。所以,Sternberger等進行了抗體片段Fab的標(biāo)記。用植物性蛋白酶---木瓜酶（Papain)水解抗體蛋白，可獲得一個無抗體活性穩(wěn)定的Fc段結(jié)晶和兩個相同的抗原結(jié)合片段（Fab)，此Fab段為單價，分子量50kD,HRP標(biāo)記后，單體分子量為90kD,較容易將單體和非標(biāo)記的Fab段分離。在此基礎(chǔ)上，Imagawa(1982)又進行了改良，引入了N-羥基丁二酰酯（Maleinmide)，標(biāo)記抗體的特定部位---Maleinmide法。該方法的主要原理是：（1)借助雙功能試劑Maleinmide活化HRP，使其具有與—Hs 基反應(yīng)的能力；（2)利用胃蛋白酶水解IgG，IgG重鏈在近羧基端被切斷，這樣在絞鏈區(qū)（Hinge region)至少可以保留一個S-S鍵，從而得到一個具有雙價抗體活性的F（ab＇)2段。該S-S鍵與抗體活性無關(guān)�？梢酝ㄟ^加入硫基乙醇（2（β)-Mercapto ethanol, HSCH2CH2OH)使其斷裂，被還原成—HS基 。如此雙價抗體活性的F（ab＇)2片段即變?yōu)閹в小狧s 基的單價Fab’片段，后者再與活化的HRP結(jié)合，便制成了酶標(biāo)抗體Fab＇。由于空間遮蔽的關(guān)系，絞鏈區(qū)即使存在兩個—HS基，也只能有一個能與酶結(jié)合，另一個—HS基不能與酶反應(yīng)，即酶與抗體Fab’段結(jié)合比例為1：1，因此酶標(biāo)抗體Fab’段絕大多數(shù)是單體，很少形成多聚體。在標(biāo)記過程中，應(yīng)用過量的活化HRP，還能避免非標(biāo)記抗體Fab＇段的存在。Fab＇段的分子量與Fab段相似（50kD左右)，所以酶標(biāo)后Fab＇亦較容易與未標(biāo)記的Fab＇分離。此標(biāo)記方法多用于酶免疫分析研究，其步驟為：
①6mg HRP溶于1.0ml PBS(pH7.0)中。
②4mg Maleinmide 溶于0.5ml N, N二甲基酰胺（N,N-dimethylformamide)中。
③將上述兩種液體充分混合，持續(xù)攪拌1h,30℃。
�、茈x心取上清，經(jīng)0.1mol/l PB(pH6.0)平衡的Sephadex G-25柱層析，收集含有蛋白部分的洗脫液，濃縮，制得活化HRP。
�、菝�1.8mg活化HRP，加入已被還原的Fab＇2mg,4℃20h持續(xù)攪拌。
⑥ Sephadex G-200/Sephacryl S-200分離酶標(biāo)抗體Fab＇片段，保存同前。
�。ㄈ�)酶標(biāo)抗體的純化
上述各種方法制備酶標(biāo)抗體時，除產(chǎn)生酶標(biāo)抗體外，還有未標(biāo)記的抗體蛋白、游離酶、酶二聚體及偶聯(lián)劑等。這些均可使酶標(biāo)抗體的敏感性下降，故酶標(biāo)抗體須經(jīng)純化后應(yīng)用�，F(xiàn)簡介幾種常用的純化方法。
1．多聚體的分離 實驗中，不同的試劑形成的多聚體的數(shù)量各異，即使同樣的實驗藥物和程序，在不同的時間制備的酶標(biāo)抗體中，多聚體的數(shù)量亦不相同。多聚體較單體含酶量多，與組織的非特異吸附增強，使方法的敏感性下降，故用前必須除去多聚體。以凝膠過濾法分離多聚體的效果較好。
2．非標(biāo)記抗體的分離 非標(biāo)記抗體與標(biāo)記抗體具有相同的免疫學(xué)特征，能競爭與組織特異抗原結(jié)合，而且親和力較標(biāo)記抗體強，優(yōu)先與組織抗原結(jié)合。一般認為每個抗體連結(jié)1～2個酶分子，并不影響抗體的兩個（Fab)抗原結(jié)合點，但因存在空間遮蔽現(xiàn)象，一個Fab段與組織特異性抗原結(jié)合。非標(biāo)記抗體則不存在這種現(xiàn)象，兩個Fab段均與抗原結(jié)合，因而親合力較強。所以酶標(biāo)抗體在應(yīng)用前須用瓊脂糖親合層析等方法去除非標(biāo)記抗體。
3．親合層析 利用蛋白A（Protein A)/瓊脂糖-刀豆素A/瓊脂糖親合層析柱能制得較純的酶標(biāo)抗體。因為蛋白A與抗體（標(biāo)記和未標(biāo)記)間有較強的親合力，不與HRP結(jié)合。而刀豆素A與HRP（標(biāo)記和游離)間的親合力非常強，不與抗體結(jié)合。據(jù)此二者并用，能獲得較純的HRP酶標(biāo)抗體。該方法省時，分離能力強（約為凝膠層析的600倍)。但有一定的局限性，因為蛋白A并非與所有種屬的免疫球蛋白親合力均較強，例：不能與羊的免疫球蛋白結(jié)合，所以難以用于純化羊的酶標(biāo)抗體。而刀豆素A與HRP的親合力極強，甚至呈不可逆性結(jié)合，可使部分酶標(biāo)抗體的活性喪失。
（四)染色原理及步驟
1．基本原理 酶標(biāo)抗體與熒光色素標(biāo)記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標(biāo)記在每一抗體上，間接法是將酶標(biāo)記在第二抗體上，檢測組織細胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。間接法所用的第一抗體是對組織細胞內(nèi)某種抗原的特異性抗體（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數(shù)單克隆抗體系由小鼠制備)；第二抗體則為第一抗體（家兔/小鼠的IgG)的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同一標(biāo)記的第二抗體就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可避免了直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。
2．染色程序
（1)切片準(zhǔn)備：見第一章 。
①石蠟切片經(jīng)二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。②固定/無固定新鮮組織冰凍切片，室溫干燥2h以上。
�。�2)未固定的新鮮組織切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，簡而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯(lián)造成的空間遮蔽（室溫)，風(fēng)干15～30min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據(jù)需要可進行組織抗原的激活。
�。�3)用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以避免孵育液流失及孵育過程中切片干燥，同時也能節(jié) 省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風(fēng)干。石蠟切片（滴少量PBS，以防其干燥)直接進行步驟（6)。
（4)切片經(jīng)PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。
�。�5)根據(jù)需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片15～30min（室溫)，封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性。應(yīng)用ALP標(biāo)記抗體時，此步可省略。
�。�6)PBS漂 洗2min（共兩次)，移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%Triton X-100)中5min（室溫)。Tween-20為一種表面活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細胞內(nèi)抗原的顯示。
�。�7)4%Block Ace或0.1%～1%BSA濕盒內(nèi)孵育15～25min（室溫)，然后；輕輕棄去孵育液（不沖洗)；以阻斷組織與抗體的非特異性結(jié)合，降低背景染色。
�。�8)根據(jù)需要，可用1/5～1/30正常來活兔/羊血清孵育15～20min（室溫，以酶標(biāo)抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動物免疫前的血清)。或者省略此步，而在稀釋酶標(biāo)抗體時，加入1%～2%的同一種屬正常血清。
（9)輕輕棄去孵育液， 滴加含0.2%BSA/0.05 NaN3/PBS稀釋的第一抗體（抗體用量：每張切片一般為50～80μl)，濕盒內(nèi)孵育1～2h（20～25℃)；免疫電鏡用標(biāo)本，4℃過夜。
（10)PBS充分沖洗（3次×2min)，以去除切片上非特異吸附的抗體。應(yīng)用不同的第一抗體或同時進行對照標(biāo)本染色時，需分別沖洗，以防相互污染。
（11)經(jīng)0.05%Tween-20/PBs 2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標(biāo)記的第二抗體,濕盒內(nèi)孵育45～60min(20～25℃)。
（12)PBS漂洗（3次×2min),此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標(biāo)抗體孵育。
�。�13)未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min（室溫)此時輕微固定，既不影響抗原抗體結(jié)合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。
�。�14)呈色：HRP標(biāo)記抗體的呈色液為0.01%～0.1%H2O2 0.01%～0.05% DAB 0.05～0.1mol/L Tris –HCl(pH7.4)。切片經(jīng)PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內(nèi)10～15min（室溫、暗處)，亦可鏡下控制顯色速度。終產(chǎn)物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標(biāo)本，呈色3～5min即可，防止DAB終產(chǎn)物向周圍擴散，影響超微結(jié)構(gòu)定位。另外，顯色液應(yīng)于用前新鮮配制，避免DAB本身氧化變質(zhì)。新配制的DAB為無色透明液體。若DAB液已氧化變?yōu)樽霞t色，應(yīng)換新藥重新配制。
�。�15)將切片置流水中（僅光鏡觀察)或PBS（電鏡標(biāo)本)內(nèi)，終止呈色反應(yīng)。
（16)未固定的冰凍切片，可用1%戊二醛-PBS液加強固定5～10min（室溫)，流水沖洗。
（17)細胞核輕度染色，以甲基綠和蘇木精為常用。前者細胞核呈綠色，與HRP/ALP等終產(chǎn)物對比度尤佳，但不適于微波照射的標(biāo)本。蘇木精是組織學(xué)、病理學(xué)研究中普遍應(yīng)用的核染色方法，與HRP、ALP的終產(chǎn)物對比度比較好。
�。�18)DAB呈色的標(biāo)本，可以系列酒精脫水、Hemo-De透明、DPX封固。其它物質(zhì)呈色的標(biāo)本，在有機溶劑中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固劑如明膠甘油等封固，次日，于蓋玻片周圍涂少許女士用指甲油，可使切片保存時間更長。
�。�19)鏡檢、觀察記錄同一般形態(tài)學(xué)研究。
（20)免疫電鏡用標(biāo)本，經(jīng)OSO4后固定，按電鏡標(biāo)本要求處理（參見本書第七章 )。亦可OSO4固定，噴碳（Carbon Coating),利用掃描電鏡觀察抗原的存在部位。
3．酶標(biāo)抗體及發(fā)色劑的選擇
HRP特異底物為H2O2,在分解H2O2過程中,與H2O2形成復(fù)合物,無電子供體存在時,反應(yīng)不再進行,當(dāng)電子供體存在時,迅速生成水,酶被還原,電子供體被氧化環(huán)化,形成苯乙胼聚合體(圖4-2)。在酶反應(yīng)部位，形成不溶性棕褐色沉淀，與組織對比清晰。
圖4-2 DAB反應(yīng)產(chǎn)物形成過程
HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異性的—酶催化底物H2O2，其余反應(yīng)是非特異的，可用各種電子供體介導(dǎo)，所以選用不同的電子供體，可使終產(chǎn)物呈不同顏色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol)為藍黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine )為深藍色，AEC（3—amino—9– ethyl--carbazole)為紅色。市售試劑盒所配顯色液以AEC居多，室溫下較穩(wěn)定，但不能進行脫水等處理，且時間長易褪色。DAB是廣泛應(yīng)用的電子供體之一，較敏感，切片可脫水透明、半永久保存，且終產(chǎn)物具有嗜餓性，經(jīng)O2O4處理，電子密度增加，適于電鏡下確定抗原的存在部位。但是DAB被認為可能具有致癌性，所以應(yīng)盡量減少吸入和接觸次數(shù)，最好將DAB制成10倍貯存液，分裝于-20℃保存，應(yīng)用時稀釋、過濾。與DAB比較，CN敏感性略差，但因其終產(chǎn)物較局限，很少彌散，光鏡觀察較為適合。
