藥物分析-授課教案:第四章藥物定量分析與分析方法驗證

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

第一節(jié) 定量分析樣品的前處理 

一、概述

1　藥物結(jié)構(gòu)與分析前處理的關(guān)系 　

1.1　有機鹵素藥物

 鹵素直接與藥物分子的碳相連者，不包括某些有機藥物的鹵酸鹽。

 結(jié)構(gòu)特點：C—X

鹵素與脂鏈相連：三氯叔丁醇

與芳雜環(huán)相連：泛影酸

1.2　含金屬有機藥物

硬脂酸鎂

1.3　有機金屬藥物

汞撒利

復習舊課（3min)

引入新課（2min)

5min

結(jié)合PPT講解。

加以比較，提高效果。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

2　不經(jīng)有機破壞的分析方法

2.1　直接測定法

直接滴定法

　 如：葡萄糖酸鈣的含量測定

氧化還原滴定法

　 如：富馬酸亞鐵的含量測定

　　　 葡萄糖酸銻鈉的含量測定

2.2　經(jīng)水解后測定

堿水解后測定法

CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH 　加熱回流

(CH3)2-CO + 3NaCl + HCOONa + 2H2O

   NaCl+AgNO3→AgCl↓+NaNO3

   AgNO3+NH4SCN →AgSCN ↓+NH4NO3

酸水解后測定法

2.3　經(jīng)還原分解后測定法

3　經(jīng)有機破壞的分析方法

3.1　濕法破壞

HNO3-HClO4法

HNO3-H2SO4法

H2SO4-K2SO4法

其它濕法： HNO3-H2SO4-HClO4法；H2SO4-H2O2法；H2SO4-KMnO4法。

40min

通過PPT講解具體實例。

50min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（一)常量凱氏定氮法

1. 原理

  樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。

①　用H3BO3吸收后再以硫酸標準溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可以計算出氮的含量。

②　也可以用過量的標準H2SO4或標準HCl溶液吸收后再以標準NaOH滴定過量的酸。

整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定

① 消化 總反應(yīng)式：

v  

  脫水作用—使有機物脫水并碳化為C、H、N。

  氧化作用—將有機物炭化后的碳氧化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫。

  2H2SO4 ＋C ＝2SO2＋ 2H2O ＋CO2

  二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

此處為新增內(nèi)容，結(jié)合PPT講解。

整個過程分幾步？

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（2)加入硫酸鉀的作用是：提高溶液沸點而加快有機物的分解（3400C→ 4000C)

K2SO4+H2SO4=2KHSO4 

   2KHSO4=K2SO4+H2O↑+SO3

   　但硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解而造成損失：

  （NH4)2SO4=NH3↑+(NH4)HSO4

2(NH4)HSO4=2NH3↑+2SO3↑+2H2O

  　 除硫酸鉀外也可加入硫酸鈉，氯化鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀。

(3)加入硫酸銅的作用

  催化作用：加速有機物的氧化分解

   C＋2CuSO4 →  Cu2SO4 ＋ SO2↑＋  CO2↑ 

   Cu2SO4 ＋ 2H2SO4 → 2CuSO4 ＋ 2H2O ＋ SO2↑

   此反應(yīng)不斷進行，待有機物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色)生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍綠色。

消化完全指示：藍綠色；

蒸餾時堿性反應(yīng)完全指示：變深藍色或產(chǎn)生黑色沉淀。

② 蒸餾

　　在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣

　　  (NH4)2SO4 + 2NaOH  →  2NH3  + Na2SO4  + 2H2O

③ 吸收

　　用硼酸溶液，并加入混合指示劑(甲基紅－溴甲酚綠)，硼酸呈微弱酸性（Ka1=5.8X10-10)，與氨形成強堿弱酸鹽，酒紅色→藍綠色。

　　2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

④ 滴定

　　待吸收完全后，再用硫酸滴定液（0.05mol/L)滴定,

藍綠色→灰紫色。

   (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=（NH4)2SO4+4H3BO3

二、 微量凱氏定氮法

適用范圍：此法主要用于測定含有氨基或酰胺結(jié)構(gòu)的藥物含量。如撲米酮等。

各試劑的作用？

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

儀器、試劑:

500mL凱氏燒瓶、凱氏定氮裝置

  消化用：①濃硫酸 ②硫酸鉀�、哿蛩徙~

　蒸餾用：④40%氫氧化鈉溶液

　滴定用：

　⑥H2SO4（0.05mol/L)標準溶液

�、�0.1%甲基紅乙醇溶液與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液混合指示劑

3.2　干法破壞

3.2.1　鈉熔法：加無水碳酸鈉高溫熾灼，進行有機破壞。本法適用于濕法不易破壞完全的有機藥物。

3.2.2　氧瓶燃燒法：是一種破壞最完全的方法，適用于有機鹵素藥物的有機破壞…。

原理：將有機藥物放入充滿氧氣的密閉燃燒瓶中進行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測物質(zhì)吸收于適當?shù)奈�收液中，然后根�?jù)欲測物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進行鑒別、檢查或含量測定。

(1)儀器裝置

氧瓶燃燒法是一種破壞最完全的方法。

樣品如何制備，操作方法如何？

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

(2)吸收液的選擇

待測元素的種類 所選用的分析方法

(4)操作法

第二節(jié)  定量分析方法特點

一、容量分析法

1.1　容量法的特點

 簡便、快速、準確，適于化學合成原料藥分析。

1.2　容量分析的計算問題

滴定度(T)

  每ml的滴定液（mol/L)相當于被測定物質(zhì)的量（mg)。

濃度校正因子（F)

滴定度（T)的計算：

百分含量的計算：

（1)直接滴定法

50min

結(jié)合具體實例講解計算問題，為后續(xù)課程的計算打下基礎(chǔ)。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

　　  W：取樣量　　　 V：消耗滴定液體積

　　  T’：實際的滴定度　T：規(guī)定執(zhí)業(yè)醫(yī)師的滴定度

（2)間接滴定法

1)生成物滴定法：葡萄糖酸銻鈉的含量測定。

2)剩余量滴定法（回滴定法)：如：例：司可巴比妥鈉的含量測定。

二、　光譜法

（一)紫外－可見分光光度法

1．特點：波長200nm～760nm

①靈敏度高，可達10-4g/ml～10-7g/ml；②準確度高，相對誤差2%～5%；③儀器價廉，操作簡便，易普及；④應(yīng)用廣泛。

2．朗伯－比耳定律

A=ELC　　　　 　　　　

3．儀器校正和檢定

由于溫度變化對機械部分影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動。應(yīng)定期全面校正及測定前校正測定波長。汞燈較強譜線或氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正。

  吸收度的準確度可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。

  雜散光的檢查。

4．對溶劑的要求

5．測定法

�。�1)對照品比較法

　（2)吸收系數(shù)法

�。�3)計算分光光度法

通過例題對測定方法加以練習。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（二)熒光分析法

1．特點　某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射后能發(fā)射出比激發(fā)光波長較長的熒光。

（1)靈敏度高，10－10g/ml～10－12g/ml。

（2)在低濃度溶液中進行。

（3)必須做空白試驗。

（4)對易被光分解的樣品，可選擇一種激發(fā)光和發(fā)射光波長與之近似而對光穩(wěn)定的物質(zhì)配成適當濃度的溶液，作為基準溶液。用基準溶液代替對照品溶液校正儀器的靈敏度。

（5)采用熒光衍生試劑，常使無熒光或弱熒光物質(zhì)得到強熒光性產(chǎn)物，擴大了熒光分析法的范圍。

（6)取樣少，方法快速。

三、色譜分析法

（一)高效液相色譜法

1．對儀器的一般要求

2．系統(tǒng)適用性試驗

（1)色譜柱的理論板數(shù)(n)

（2)分離度

（3)重復性

（4)拖尾因子

3．測定法

（1)內(nèi)標法加校正因子測定供試品中主成分含量

（2)外標法測定供試品中主成分含量

　�、贅藴是�線法；

②外標一點法。

（二)氣相色譜法

1．對儀器的一般要求

2．系統(tǒng)適用性試驗

3．測定法

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

第三節(jié)  藥物質(zhì)量標準分析方法驗證

方法驗證的目的

   為保證分析結(jié)果的可靠性需對分析方法進行質(zhì)量控制、進行認證（validation)和評價�！胺治龇椒�驗證”的目的是證明采用的方法適應(yīng)于相應(yīng)的檢測要求。

  不同的檢測要求和不同的分析方法有其相應(yīng)的驗證標準和方法。  

適用范圍

藥品質(zhì)量標準起草。

在藥物生產(chǎn)方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進行修訂時，所變更的方法。

體內(nèi)分析方法的建立。

驗證內(nèi)容

1　準確度　（Accuracy)

1.1　定義

測定結(jié)果與真實值或參考值接近的程度。

1.2　表示　　

	裝 訂 線

1.3　含量測定方法的準確度

1.3.1　原料藥

有已知純度的對照品或樣品，可直接采用建立的方法測定樣品計算回收率。

若無已知純度的對照品或樣品，必須用所建立的方法測得結(jié)果與己建立準確度的另一種方法測定的結(jié)果進行比較。

1.3.2　制劑

用含有已知量被測物的模擬處方進行測定。

如不能得到制劑的全部組分，可用加樣回收率衡量準確度。

與標準方法比較。

1.4　數(shù)據(jù)要求

在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測定結(jié)果進行評價。報告加入量的回收率（%)或測定結(jié)果平均值與真實值之差及其相對標準偏差或可信限。

2　精密度（Precision)

2.1　定義

 　同一均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果

之間的接近程度。

2.2　表示方法

30min

不同的檢測要求和不同的分析方法有其相應(yīng)的驗證標準和方法。特別是有實習過程中，每個學生都 要有自己的課題，其中要接觸到相關(guān)內(nèi)容。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

2.3重復性、中間精密度及重現(xiàn)性

2.3.1重復性（repeatability)

    相同的條件，由同一人員用同一儀器測定所得結(jié)果的精密度。

日內(nèi)精密度 (within day precision)

日間精密度(day to day precision)

中間精密度（intermediate precision)：同－實驗室,不同時間由不

同人員用不同儀器測定所得結(jié)果的精密度。

重現(xiàn)性（Reproducibility)：不同實驗室，由不同人員測定所得結(jié)

果的精密度。 

3　專屬性（Specificity)

選擇性（selectivity)是指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時該方法對供試物準確而專屬的測定能力。

3.1　鑒別反應(yīng)

　　　結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)呈負反應(yīng)。

3.2　含量測定和雜質(zhì)測定

雜質(zhì)對照品可獲得  　模擬樣品　

雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得

　   同其它方法比較或用加速破壞法

4.檢測限（Limit of detection, LOD)

4.1　定義

試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量。

4.2　方法

非儀器分析目視法

信噪比法

　 S/N=3(2)

5 定量限（Limit of quantitation LOQ)

5.1 定義

樣品中被測物能被定量的最低量。

非儀器分析方法

儀器分析方法

S/N＝10：1

6　線性（Linearity)

6.1 定義

 　在設(shè)計的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

　  最小二乘法求回歸方程

　  相關(guān)系數(shù)大于0.999（n≥5)

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

7　范圍（Range)

7.1 定義

　　測試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間

7.2　原料藥和制劑的含量測定

　　范圍應(yīng)為測試濃度的80%～120%。

7.3　制劑含量均勻度檢查

　　范圍應(yīng)為測試濃度的70%～130%。

8　耐用性（Robustness)

　　在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度。

效能指標的使用要求：

o   非定量分析方法　如鑒別試驗除專屬性、耐用性外，其它都不要求。

o   雜質(zhì)的限量檢查除專屬性、檢測限、耐用性外，其它都不要求。雜質(zhì)的定量測定除檢測限外，其它都要求。

o   含量測定及含量均勻度、溶出度或釋放度的測定除檢測限、定量限外，其它都要求。

一、常用樣品的種類、采集和貯藏

(一)血樣

(二)唾液

(三)尿液

二、生物樣品分析前處理技術(shù)

(一)蛋白質(zhì)的去除

(二)綴合物的水解

(三)有機破壞

(四)分離、純化與濃集

(五)化學衍生化法

三、定量分析方法的驗證

(一)特異性

(二)標準曲線與線性范圍

(三)精密度與準確度

(四)定量下限

(五)樣品的穩(wěn)定性

(六)提取回收率

(七)質(zhì)控樣品

(八)質(zhì)量控制

(九)測定結(jié)果

10min

問題討論(5min)；

作業(yè)和習題布置2(min)；

歸納總結(jié)(3min)。

小 結(jié)

本章主要內(nèi)容為：1.定量分析樣品的前處理；2.定量分析方法的特點；3.藥品分析方法的驗證；4. 生物樣品分析方法的基本要求。

復習思考題

或

作 業(yè) 題

1.試述氧瓶燃燒法的原理、特點、應(yīng)用范圍、吸收液的作用及選擇原則。

2.干法破壞是如何進行的？

3.生物樣品的前處理主要考慮哪幾個方面的問題？

教 學 效 果

與 分 析

多媒體教學和板書相結(jié)合，并結(jié)合一定的實例，加深學生對知識點的認識和了解。特別是通過問題討論，讓大家對所學知識進行回顧、討論，建立一個互動的教學氛圍。效果較好，為下節(jié)課的繼續(xù)學習打下基礎(chǔ)。