醫(yī)學(xué)論文范文:人前腦啡肽原綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

 醫(yī)學(xué)論文范文:人前腦啡肽原綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

【摘要】 目的 構(gòu)建人前腦啡肽原(preproenkephalin,PENK)綠色熒光真核表達(dá)載體并進(jìn)行鑒定。方法 參照PENK基因全序列，在cDNA兩端各設(shè)計(jì)一條對(duì)應(yīng)引物，并引入各自酶切位點(diǎn)。通過RT�睵CR的方法從正常人腦組織中擴(kuò)增出目的基因，并定向克隆至pEGFP�睠3綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體上。篩選陽性克隆，通過雙酶切和測(cè)序法鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果 雙酶切結(jié)果與目的基因表達(dá)的條帶完全吻合，克隆測(cè)序結(jié)果與NCBI收錄的PENK序列完全一致。結(jié)論 成功構(gòu)建pEGFP�睠3�睵ENK載體，為進(jìn)一步研究疼痛的基因治療奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 綠色熒光載體;真核表達(dá);人前腦啡肽原

Construction of Human PENK and Green Fluorescent

Protein Eukaryotic Vector

LI Yong�瞙ui, HU Yi�瞝e, TU Xin�瞞ing, et al

(Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Abstract:Objective To construct and identify the human PENK and green fluorescent protein eukaryotic vector. Methods To correspond to the PENK gene sequences, introduce respective restriction sites in each end of cDNA; and obtain the target gene from the normal tissue of brain by RT�睵CR, then connect the target gene to the pEGFP�睠3 green fluorescent protein eukaryotic vector; and choose the positive clones to identify the recombinant plasmids by double disgestion and sequencing. Results Double disgestion results and the expression of target gene band matched completely; the clone sequencing results were the same as the sequence of PENK contained in NCBI results. Conclusion pEGFP�睠3�睵ENK vector is successfully constructed for the further study of the gene therapy of pain.

Key words:green fluorescent vector;eukaryotic expression; PENK

癌癥晚期病人的疼痛治療是目前醫(yī)療界的一項(xiàng)難題，傳統(tǒng)的阿片類鎮(zhèn)痛藥物雖有較好的效果，但由于其具有成癮性、呼吸抑制等副作用限制了在臨床上的使用[1]。20世紀(jì)80年代以后，基因技術(shù)的快速發(fā)展為疼痛的基因治療開辟了一個(gè)新時(shí)代 [2，3]。腦啡肽[4，5]是機(jī)體自身合成的一種內(nèi)源性阿片肽，無阿片類藥物的副作用且有較好的鎮(zhèn)痛作用，目前已經(jīng)成為疼痛研究的一個(gè)新方向。本實(shí)驗(yàn)將人體內(nèi)控制腦啡肽合成的前腦啡肽原基因與pEGFP�睠3載體連接，構(gòu)建成前腦啡肽原綠色熒光真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究疼痛的基因治療奠定了基礎(chǔ)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.bhskgw.cn。

1 材料與方法

1.1 腦組織來源 取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院因顱腦外傷意外死亡患者的腦組織(死亡0.5 h內(nèi))。

1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒cDNA 第一鏈合成試劑盒、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購于大連寶生物公司;JM109菌、pEGFP�睠3質(zhì)粒由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;PE4800型PCR儀產(chǎn)自美國PE公司;722型電泳儀、水平電泳槽產(chǎn)自上海醫(yī)療器械廠;其他普通試劑購于國內(nèi)各大試劑公司。

1.3 總RNA的提取 無菌條件下取出腦組織，按照大連寶生物公司的總RNA提取試劑盒說明書操作，具體步驟如下：①在超凈工作臺(tái)中取腦組織，在冰盒上切成約100 mg的小塊，置于1.5 mL離心管中及時(shí)使用或-80℃凍存?zhèn)溆�。②取一塊100 mg的腦組織置于研磨器中加入液氮迅速用力研磨3～5次。③加入450 μL RLT solution，用力晃動(dòng)或用槍頭吹打使其混勻，充分裂解后將裂解液吸入RNase�瞗ree的EP管中，在56℃水浴3 min。④水浴完成后加入250 μL的無水乙醇。⑤取700 μL的樣品放于2 mL收集管中的過濾柱中。置于低溫離心機(jī)中4℃ 8 000 r/min離心1 min。⑥倒去收集管中的廢液，加入500 μL的RW solution于柱中，靜置1 min，置于4℃低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心1 min。⑦倒去收集管中的廢液，加入500 μL的RPE solution于柱中，置于4℃低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心1 min，重復(fù)⑤1次。⑧倒去收集管中的廢液，置于4℃低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心15 s。⑨將濾柱放入無菌的RNase�瞗ree的1.5 mL離心管中，加30～50 μL DEPC�睭2O到柱膜中央，在50℃恒溫水浴鍋中放置2 min，置于4℃低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心1 min，收集，分為10 μL/管，-70℃凍存或立即使用。

1.4 RT�睵CR 根據(jù)GenBank報(bào)道的人前腦啡肽原基因序列, 使用Primer5.0設(shè)計(jì)引物，上游和下游引物分別加上HindⅢ和BamHI的酶切位點(diǎn)，

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