| 公開(公告)號 | CN1869210A |
| 公開(公告)日 | 2006.11.29 |
| 申請(專利)號 | CN200610040269.8 |
| 申請日期 | 2006.07.19 |
| 專利名稱 | 人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法及其該酶的應(yīng)用 |
| 主分類號 | C12N9/10(2006.01)I |
| 分類號 | C12N9/10(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I;A61K38/45(2006.01)I;A61P31/00(2006.01)I;A61P31/04(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南京師范大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 殷志敏;沈佳胤;羅 蘭;張 泓;王 宇 |
| 地址 | 210097江蘇省南京市寧海路122號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京蘇高專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 闕如生 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法，其純化步驟如下： (1)、將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37℃振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/L LB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，用去離子水定容至1升，37℃振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)2～4h，OD600達(dá)到0.5～0.6時(shí)，加異丙基β-半乳糖甘至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體； (2)、按每g菌體沉淀加5mL 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM咪唑，PH7.9的結(jié)合緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4℃離心15min后取上清，上清與經(jīng)結(jié)合緩沖液預(yù)平衡過的IDA-Ni2+樹脂在4℃結(jié)合40min，用以上結(jié)合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM咪唑，PH7.9的洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，PH7.9的洗脫緩沖液洗脫3次； (3)、合并3次洗脫液上清，用0.5M NaCl，20mMTris-HCl，PH7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mM EDTA，PH6.5透析液2透析測定酶活性； (4)、用140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4的PBS緩沖液透析測定蛋白濃度，用凝血酶水解切割His6標(biāo)簽，得到人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi的純化方法，其方法步驟為：(1)將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coli BL21/DE3菌株接種于LB固體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體；(2)按每g菌體沉淀加入pH7.9的結(jié)合緩沖液重懸收集菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎、離心后取上清液，用緩沖液洗脫；(3)將洗脫上清用透析液1透析去咪唑，再用透析液2透析測定酶活性；(4)用PBS緩沖液透析，用凝血酶水解切割His6標(biāo)簽，獲得人谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。本發(fā)明方法純化得到的hGSTpi重組蛋白純度高，且空氣氧化形成的無活性二聚體少，hGSTpi在炎癥治療中的應(yīng)用，不僅能有效控制炎癥，而且對機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響小，副作用極小。 |
| 國際公布 |
