| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1221567C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2005.10.05 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN02134404.3 |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.07.19 |
| 專利名稱 | 生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法 |
| 主分類號(hào) | C07K14/435 |
| 分類號(hào) | C07K14/435;C12N15/09;C12P21/02 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 廣州銘康生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 劉龍斌;楊琴;王敏榮;王軍志 |
| 地址 | 510730 廣東省廣州市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)友誼路173號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 廣州知友專利代理有限公司 |
| 代理人 | 邵毓琴 |
| 國(guó)省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，依次包括以下步驟：(1)定點(diǎn)突變天然t-PA獲得含突變位點(diǎn)的TNK-tPA突變體基因；(2)構(gòu)建表達(dá)載體pCdhfr；(3)以XhoI/XbaI雙酶切含TNK-tPA基因的人工合成DNA序列，回收含目的基因的7Kb的DNA片段，與以XhoI/XbaI雙酶切的真核表達(dá)載體pCdhfr連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliJM109，以載體上的通用引物做PCR初步篩選克隆，取陽(yáng)性克隆株培養(yǎng)，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pCdhfr-mt-PA；(4)以TNK-tPA突變體表達(dá)質(zhì)粒pCdhfr-mt-PA轉(zhuǎn)染CHO-DHFR-細(xì)胞，經(jīng)克隆和篩選獲得高水平表達(dá)TNK-tPA的工程細(xì)胞株；(5)利用細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器持續(xù)培養(yǎng)工程細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)分離純化獲得rhTNK-tPA突變體。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)重組人組織型纖溶酶原激活劑TNK突變體的工藝方法，該方法采用全長(zhǎng)基因合成的方法合成含上述突變位點(diǎn)的TNK-tPA基因，在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO-DHFR-)中表達(dá)，經(jīng)克隆和篩選獲得高水平表達(dá)TNK-tPA的工程細(xì)胞株，利用細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器持續(xù)培養(yǎng)工程細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，經(jīng)一系列柱層析分離純化技術(shù)，獲得rhTNK-tPA制品。本發(fā)明的目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平高達(dá)18000IU/106cell/d，由此制備的rhTNK-tPA的單鏈比例高達(dá)80％以上，純度高達(dá)95％以上；對(duì)于工業(yè)化規(guī)模而言，本發(fā)明所需的設(shè)備相對(duì)比較簡(jiǎn)單，成本低，工藝條件簡(jiǎn)單。 |
| 國(guó)際公布 |
