| 公開(公告)號(hào) | CN1139654C |
| 公開(公告)日 | 2004.02.25 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN01131813.9 |
| 申請(qǐng)日期 | 2001.12.07 |
| 專利名稱 | 定量測(cè)定骨形成蛋白（BMP)活性細(xì)胞株的建立方法 |
| 主分類號(hào) | C12N5/10 |
| 分類號(hào) | C12N5/10;C12Q1/25;C12Q1/06 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 朱幫福;陳蘇民;陳南春 |
| 地址 | 710032 陜西省西安市長(zhǎng)樂(lè)西路17號(hào) |
| 頒證日 | 2004.02.25 |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 西安通大專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 李鄭建 |
| 國(guó)省代碼 | 陜西;61 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 定量測(cè)定骨形成蛋白活性的細(xì)胞株的建立方法，包括以下步驟：a.首先將串聯(lián)6個(gè)BMP作用關(guān)鍵元件的骨鈣素部分啟動(dòng)子連接上熒光素酶報(bào)告基因，克隆、構(gòu)建其真核表達(dá)載體；該啟動(dòng)子序列為：5’-CCAAC CACACCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACA CCAAC CACAGCC GAT ATA AAT GCT ACT GGA TGC TGG AGG GTG CAG AAC AGA CAAGTC-3’；b.然后轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞C2C12中，利用載體本身的抗性基因用抗生素進(jìn)行壓力篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株；熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物為熒光素酶，熒光素酶的活性可通過(guò)檢測(cè)其分解底物產(chǎn)生熒光量測(cè)得；具體檢測(cè)方法為：收集BMP刺激、培養(yǎng)2天的單克隆細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，待細(xì)胞完全裂解后高速離心5分鐘，然后取部分離心上清，加入到一定量的熒光素酶作用底物液中，在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀上測(cè)定產(chǎn)生熒光量；上述真核表達(dá)載體也可轉(zhuǎn)入其它細(xì)胞系，如NIH3T3、C3H10T1/2細(xì)胞中；c.通過(guò)檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)BMP作用的反應(yīng)性，最終挑選到對(duì)BMP刺激反應(yīng)強(qiáng)度高、檢測(cè)指標(biāo)—熒光素酶分解產(chǎn)生熒光量靈敏的細(xì)胞株；d.經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性等檢驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞株穩(wěn)定可靠，適用于BMP活性的定量測(cè)定。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種定量測(cè)定骨形成蛋白(BMP)活性的細(xì)胞株的建立方法，利用分子生物學(xué)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BMP作用靶分子骨鈣素的部分啟動(dòng)子(串聯(lián)6個(gè)關(guān)鍵作用元件)連同熒光素酶報(bào)告基因，轉(zhuǎn)入成肌細(xì)胞C2C12中，經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株，并檢測(cè)各細(xì)胞株對(duì)BMP作用的反應(yīng)性；最終挑選到對(duì)BMP刺激反應(yīng)強(qiáng)度高、檢測(cè)指標(biāo)(熒光素酶)靈敏的細(xì)胞株。經(jīng)過(guò)特異性、穩(wěn)定性等檢驗(yàn)，證實(shí)該細(xì)胞株穩(wěn)定可靠；通過(guò)檢測(cè)多批BMP樣品結(jié)果顯示，BMP的作用劑量大小與熒光素酶活性高低呈良好的線性正相關(guān)。本發(fā)明所建立的細(xì)胞株適用于BMP活性的定量測(cè)定。 |
| 國(guó)際公布 |
