| 公開(公告)號(hào) | CN101003816A |
| 公開(公告)日 | 2007.07.25 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200710008445.4 |
| 申請(qǐng)日期 | 2007.01.11 |
| 專利名稱 | 人PEX分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用 |
| 主分類號(hào) | C12N15/85(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 廈門大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 呂文清 |
| 地址 | 361005福建省廈門市思明南路422號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 陳永秀;馬應(yīng)森 |
| 國(guó)省代碼 | 福建;35 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 人PEX分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟： 步驟1、pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)以從胎盤提取的組織總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成PEX cDNA第一條鏈； (2)根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)和載體pGEX-4T-3(AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR引物PEX446S：序列為5’-CTG AAT TCC TCTCCT GAC ATT GAC CTT G-3’，上游引物，帶限制性內(nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn)；PEX660A：序列為5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’，下游引物，帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn)； (3)以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條鏈為模板，利用PCR技術(shù)，用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1629bp～2304bp片段，即長(zhǎng)度為676bp的PEX cDNA片段，并重組入載體pGEX-4T-3中，得編碼人MMP2從446aa到660aa的PEX片段PEX215； (4)將PEX215重組于GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-3，獲得序列正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/PEX215； 步驟2、PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2 C端片段PEX cDNA 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.：NM_004530)及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense，其中上游引物PEX466sense，序列為5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’，帶限制性內(nèi)切酶Sfi I酶切位點(diǎn)；下游引物PEX660antisense，序列為5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’，帶限制性內(nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn)；以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板，用引物PEX466sense與PEX660antisense一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1685bp～2269bp片段，即585bp的PEX cDNA片段，編碼人MMP2從466aa到660aa的PEX蛋白； 步驟3、真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的PEX cDNA片段和載體pSecTag A經(jīng)Sfi I和XhoI雙酶切后，經(jīng)連接酶連接后構(gòu)建質(zhì)粒pSecTag A/PEX，該質(zhì)粒表達(dá)的PEX蛋白N端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈，C端帶有Myc表位標(biāo)簽，Ig κ-鏈前導(dǎo)肽可介導(dǎo)PEX分泌到胞外，Myc表位檢測(cè)標(biāo)簽可用于外源性PEX蛋白的檢測(cè)以區(qū)別于內(nèi)源性PEX蛋白。 |
| 摘要 | 人PEX分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，涉及一種真核表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)人MMP2序列及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense，以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板，以PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2C端片段PEXcDNA，再構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX。構(gòu)建方法更加簡(jiǎn)捷，同時(shí)用人PEX cDNA作為插入片段構(gòu)建的真核表達(dá)載體更有利于人PEX細(xì)胞功能研究和相關(guān)應(yīng)用研究。所構(gòu)建的質(zhì)粒可作為一種基因治療藥物用于腫瘤等相關(guān)疾病的治療。 |
| 國(guó)際公布 |
