公開(公告)號
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CN100347307C
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公開(公告)日
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2007.11.07
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申請(專利)號
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CN200510042989.3
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申請日期
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2005.07.25
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專利名稱
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重組嵌合分子Cb1-Grb2(SH2)-RING真核表達質(zhì)粒及抗腫瘤基因藥物用途
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主分類號
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C12N15/79(2006.01)I
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分類號
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C12N15/79(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權
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申請(專利權)人
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中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
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發(fā)明(設計)人
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李 霞;張 璟;劉新平;藥立波
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地址
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710032陜西省西安市長樂西路17號
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構
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西安通大專利代理有限責任公司
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代理人
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李鄭建
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國省代碼
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陜西;61
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主權項
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重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING真核表達載體的構建方法,其特征在于: 首先將BamHI引入CblN基因的SH2N端,獲得CblN(BamHI);以CblN(BamHI)為模板,同法將EcoRV引入CblN基因的SH2C端獲得CblN(BamHI+EcoRV); 將CblN(BamHI+EcoRV)克隆入pGEM-Teasy載體進行測序,測序正確后利用KpnI/XhoI酶切并將其插入到pcDNA3.1(+)真核表達載體的KpnI/XhoI酶切位點之間,即得到pcDNA3.1(+)-CblN(BamHI+EcoRV); 再以SK-BR-3細胞的cDNA為模板,設計引物擴增得到Grb2SH2基因片段并克隆到pGEM-Teasy載體中,酶切鑒定及測序證實序列正確后,以BamHI和EcoRv雙酶切將Grb2SH2基因片段切出,并將經(jīng)同樣酶切的pcDNA3.1(+)-CblN(BamHI+EcoRv)載體片斷分別回收,兩片段經(jīng)T4連接酶進行連接反應,連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞DH5α,挑取單克隆培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒,經(jīng)BamHI和EcoRv雙酶切鑒定后,對獲得預期大小的插入片段的載體再進行測序證實,命名為pcDNA3.1(+)-Cbl-Grb2(SH2)-RING,即為重組嵌合分子Cbl-Grb2(SH2)-RING的真核表達質(zhì)粒。
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摘要
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本發(fā)明公開了重組嵌合Cb1泛素連接酶Cb1-Grb2(SH2)-RING真核表達載體的構建方法,所構建的表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Cb1-Grb7(SH2)-RING能夠作為抗HER2陽性腫瘤的基因藥物。經(jīng)實驗證明:重組嵌合分子Cb1-Grb2(SH2)-RING真核表達質(zhì)粒轉染HER2陽性乳腺癌細胞系SK-BR-3后,通過與HER2蛋白結合并促進其泛素化、下調(diào),能夠有效抑制與HER2過度活化有關的細胞的增殖,因而具有抗HER2陽性腫瘤的用途。
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國際公布
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