針對豬圓環(huán)病毒的檢測技術(shù)研究
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豬圓環(huán)病毒 病是由豬圓環(huán)病毒(PCV)感染引起的，以免疫抑制為特征的一類病毒性 傳染病 ，臨床表現(xiàn)主要是由PCV-2引起的 仔豬 斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征。文章就近幾年國內(nèi)外對該病毒檢測技術(shù)，包括病毒分離、電鏡觀察、聚合酶鏈式反應(yīng)、間接免疫熒光試驗、免疫組織化學技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、原位核酸雜交試驗等的研究進展做了闡述�！ ∝i圓環(huán)病毒病是近年來倍受關(guān)注的一種在世界各地廣泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的總稱。自1974年Tischer I等 首次發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)以來，隨著對PCV研究的深入，根據(jù)豬圓環(huán)病毒的致病性及其基因組差異又可將其分為無致病性的豬圓環(huán)病毒1型(PCV-1)和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)。PCV-1對豬無致病性，但能產(chǎn)生血清抗體，在豬群中普遍存在，接種2日齡與9日齡的豬無臨床癥狀。PCV-2對豬有致病性，主要導致一種以斷奶仔豬呼吸急促或困難、
腹瀉、貧血、明顯的淋巴組織病變和進行性消瘦為特征的新的疾病，即斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，造成了很大的經(jīng)濟損失。由于豬群中普遍存在著PCV抗體，單一的抗體陽性不能確診為陽性，確診必須依靠實驗室方法檢測出PCV-2抗原或核酸。由于病毒復(fù)制困難，所以檢測和防控研究非常困難。同時，該病易與一些病毒性和細菌性疾病混合或繼發(fā)感染，因此僅憑癥狀、病變及
流行病學調(diào)查很難做出準確判斷。為此，各國獸醫(yī)工作者進行了大量的研究，建立了多種高度特異性的病毒學、免疫學和分子生物學診斷方法。文章就目前國內(nèi)外PCV的檢測技術(shù)研究進展進行綜述。 1病毒分離 豬圓環(huán)病毒的分離培養(yǎng)多數(shù)是從病豬中采取肺、肝、脾、淋巴結(jié)和扁
桃體等組織，制成組織勻漿，用氯仿處理除去有囊膜的病毒，接種PK-15細胞，利用氨基
葡萄糖短時間處理感染細胞，以促進病毒的增殖。呂艷麗等 從北京、河北分離了3株P(guān)CV-2，并對其中的2株進行了測序，序列分析比較發(fā)現(xiàn)，它們與歐美分離毒株具有很高的同源性。郎洪武等 用Dulac
豬腎傳代細胞分離到了2株圓環(huán)病毒。崔尚金等從我國的22個省市分離到了32株豬圓環(huán)病毒，并對其中6株進行了測序，呈送到GenBank。另外，還有很多研究人員從各地分離到多株豬圓環(huán)病毒�！ �2電鏡觀察 電鏡下可以觀察到一種較小病毒，是豬圓環(huán)病毒特有的直徑約為17 nm的球型結(jié)構(gòu)，以及大量不同形態(tài)的胞漿內(nèi)包涵體�！ �3聚合酶鏈式反應(yīng)檢測 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)做為一種快速、簡便、特異的診斷方法，目前為病毒學診斷、分子生物學實驗最常用的技術(shù)，其優(yōu)點為敏感、特異、快速、準確。在PCV 的檢測方面應(yīng)用廣泛，且發(fā)展了很多改良的技術(shù)�！ �3.1多重PCR 檢測 Huang C I等 建立了一種簡單的多重PCR法，可對PCV 進行檢測和定型。該方法設(shè)計了兩套引物，是根據(jù)PCV核酸鏈上的ORF1和ORF2設(shè)計的。Calsamiglia M等 建立了一種多重PCR法，可對PCV進行檢測和定型。作者根據(jù)PCV-1和加拿大PMWS豬中分離的PCV-2的ORF1和ORF2序列設(shè)計兩套引物，這兩套引物都可以對PCV進行檢測和定型。郎洪武等 根據(jù)PCV種的特異性和PCV-2型的特異性，設(shè)計兩對PCR引物，進行多重PCR檢測PCV。一對引物擴增出的片段具有PCV種的特異性，擴增區(qū)域是相對保守的ORF1部分核苷酸片段，大小約為900 bp。另一對引物擴增出的片段具有PCV-2型的特異性，擴增區(qū)域呈可變性相對較大的ORF2部分的核苷酸片段，大小約為470 bp。Kim J等 在2003年建立了石蠟包埋組織中同時檢測PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法，檢測了人工感染病例和自然感染病例，結(jié)果與原位雜交方法完全一致。 3.2定量競爭性PCR檢測 定量PCR是根據(jù)PCR的產(chǎn)物量來推斷其原始模板量。Liu Q等 建立了競爭性PCR方法檢測血清中的PCV 的DNA。選取PCV-1和PCV-2的ORF2中變異性高的區(qū)段設(shè)計兩對型特異性引物，并引入一個外源片段的重組質(zhì)粒，以此作為競爭性模板，用上述兩對引物擴增出的PCV-1或PCV-2片段能夠與野毒株的擴增片段相區(qū)別。當倍比稀釋的已知濃度的質(zhì)粒DNA和待測DNA共同的PCR產(chǎn)物的電泳條帶亮度相同時，便可以推算出待測DNA的濃度。崔尚金等 運用此方法在試驗過程中采用內(nèi)標競爭模板，競爭模板和目標模板共用一個反應(yīng)體系，不僅降低了非內(nèi)標性模板不同PCR反應(yīng)管間的差異，而且在對樣本進行質(zhì)控監(jiān)測，排除了假陰性結(jié)果�！ �3.3復(fù)合PCR檢測 復(fù)合PCR是一種特殊的PCR技術(shù)，即在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，擴增多個基因片段，此法方便快捷，已廣泛用于醫(yī)學臨床診斷。蘆銀華等 應(yīng)用復(fù)合PCR，在同體系中用3條引物擴增PCV兩種血清型的DNA片段，從而達到PCR擴增一次就可檢測鑒別PCV-1和PCV-2的目的。試驗從PK-15細胞中擴增出了PCV-1和PCV-2特異的基因片段，表明復(fù)合PCR方法的建立，為PCV的檢測、分型及臨床PMWS的診斷提供了有效的工具。朱軍莉等 1 采用復(fù)合PCR，對浙江、上海等地的豬場，具有明顯的“高熱綜合征”臨床表現(xiàn)豬的淋巴結(jié)進行檢測，發(fā)現(xiàn)PCV-2的陽性率為39.40%，而PCV-1的陽性率為33.33%。
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