豬的冷凍精液技術研究進展
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豬冷凍精液技術是指利用干冰（-79℃)、液氮霧等作冷卻源，將精液特殊處理后，保存在超低溫的液氮（-196℃)狀態(tài)下，達到長期保存的目的，并且解凍后輸精的過程。自Polge等1956年開始豬的凍精研究試驗以來，許多國家相繼開展了此項技術的研究，目標是提高它的繁殖成績，達到現(xiàn)場生產(chǎn)可接受的水平。我國養(yǎng)豬業(yè)已從傳統(tǒng)的副業(yè)型轉變到效益型、專業(yè)化的瘦肉產(chǎn)品生產(chǎn)，豬的常溫液態(tài)保存精液技術已經(jīng)被大面積地推廣和應用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中。精液冷凍保存是人工授精的一項重大變革，不但解決了精液長期保存的問題，有利于本地豬種資源保護，還使精液不受時間、地域的限制，便于開展省際、國際之間的協(xié)作，提高優(yōu)良種豬的利用率；而且極大地延長了種豬基因物質的使用壽命，使優(yōu)良種豬在短期進行后裔測定，保留和恢復精液供應、血統(tǒng)更新、引種、降低生產(chǎn)成本等方面均有重要意義。隨著全國性、區(qū)域性種豬聯(lián)合育種工作的深入開展，豬的冷凍精液技術研究越來越顯得迫切。一、豬冷凍精液技術的現(xiàn)實意義和局限性 與豬的常規(guī)溫度（15℃～17℃)液態(tài)保存相比，豬的冷凍精液技術具有以下現(xiàn)實意義和局限性： 1) 由于凍精可以使優(yōu)良基因得到無限期的保存（如本地豬種資源保護)，延長公豬使用年限，而不受該公豬死亡、損傷、采精間隔或繁殖不育的限制，有利于人為地使用高性能水平的種公豬與較多數(shù)量的母豬配種，獲得更大的遺傳進展； 2) 使種豬選擇擴大到世界范圍的各群體進行成為可能，不受時間或地理位置差異的限制，引進國外高性能公豬凍精取代進行活體公豬，可節(jié)省外匯支出； 3) 有利于人工授精體系的完善，公豬冷凍精液可以在后裔測定或疾病檢測后才開始大量供應，為穩(wěn)定的遺傳進展和嚴格的生物安全提供額外保障。從健康角度考慮，凍精為疾病檢測提供了足夠的時間，凍精還為大型的人工授精站暴發(fā)疾病時提供了穩(wěn)定的精液供應保障�！ ‘斍埃i的凍精應用估計占世界人工授精不到1%的比例(Wagner and Thibier 2000)，這個比例在許多年里都沒有大的變化(Reed 1985,Almlid and Hofmo 1996)。 4) 凍精沒有得到大面積的主要原因是繁殖成績不理想。與常規(guī)液態(tài)保存精液相比較，分娩率為40%～70%，低20%～30%，窩產(chǎn)仔數(shù)為7～10頭，少2～3頭（Johnson 1985,Almlid and Hofmo 1996)�！ �5) 凍精的體外活力和解凍后受精能力在不同的種公豬個體之間存在很大的差異�！ �6) 液態(tài)保存精液每劑只需要20～30億精子數(shù)，而凍精每劑需要更多的精子，一般為50～60億。 7) 成本高，從工作量和實驗室設備考慮，冷凍和解凍是一個耗費資金的過程�！ �8) 需要可靠的實驗室設備以供準確測試精液質量，最大的問題是解決體外精子的活力與其實際的受精力、受胎效果的相關性�！ �9) 把握適時輸精的時機。凍精輸入母豬體內后的理想受精時間比液態(tài)保存精液大大縮短了�！ ∫虼�，繼續(xù)改進豬精子的冷凍和解凍操作方案仍是養(yǎng)豬業(yè)面臨的一個課題。豬精子與其他家畜相比，有許多不同之處。它一次射精量大，采精后對外界溫度的突然改變相當敏感（所謂的“冷
休克”反應)。冷凍精液技術的成功與否，關鍵在于對影響豬精子在冷凍和解凍過程中失去活力、保持受精能力等多因素的理解和監(jiān)控。這些因素包括外界因素、精子本身生物學特性、種公豬個體差異和每次采精的質量差異。外界因素有稀釋液的組成成分、抗凍劑選擇及其濃度、稀釋比例和冷卻或緩沖速度、冷凍和解凍所采取的方法(Johnson et a1 2000)。遺憾的是我們只能通過改變外界因素來優(yōu)化冷凍精液操作過程和提高繁殖成績�！ 榱诉m應
豬肉的高效、優(yōu)質生產(chǎn)需要，全世界的種豬都在不斷地被更高遺傳水平的群體所更新，在一個國家或地區(qū)范圍內，采用保存3～5天的液態(tài)精液或者活種豬進行遺傳物質傳遞已經(jīng)足夠，但從我國幅員遼闊的地域、種豬的跨國家貿易和在遺傳交流時減少疾病傳播的角度考慮，豬的冷凍精液技術需求非常迫切。二、豬冷凍精液技術研究簡史 1949年英國Polge等發(fā)現(xiàn)
甘油（丙三醇)對牛精子具有抗凍保護作用，1956年開始應用這個原理進行豬精子的冷凍操作，但在1950～1960期間的研究結果中，冷凍保存、解凍后的精子具有活力，但無法獲得受胎結果。雖然在1970之前有幾例豬的凍精成功受胎的報道，但其結果不能被重復。1970年開始，Polge 等學者利用外科腹腔授精法將解凍后的精子直接注入輸卵管而獲得83%的受精卵，其后，多個研究小組如美國的Crabo and Einarsson 1971； Graham et a1 1971； Pursel and Johnson 1971；法國Paquignon & du Mesnil du Buissson 1973; 澳洲Salamon & Visser (1972，1973，1974)和德國的Westendorf et al （1975)相繼報道了以常規(guī)的子宮頸輸精并成功分娩的凍精技術試驗結果，終于闡明低溫保存后豬的精子仍具有受精的能力。從此，世界學者為了把豬的冷凍精液技術應用到養(yǎng)豬生產(chǎn)實踐中作了許多努力，并對操作程序進行不斷優(yōu)化。迄今為止，人們仍沿用細管(Westendorf et a1 1975) 、顆料(Pursel and Johnson 1975)及其改良型保存裝置進行豬精子的冷凍和保存。雖然凍精仍保持一定的受精能力，但產(chǎn)活仔數(shù)、受胎率等繁殖結果明顯低于液態(tài)保存精液(Johnson 1985)。因此，采用長效、低成本、切合實際的液態(tài)保存精液技術得到了不斷的改進，可以部分解決國際間遺傳物質的交流，受胎率也很接近自然交配結果。所以，即使凍精的繁殖效果與液態(tài)保存精液達到相似的程度，也不會取代液態(tài)保存精液技術的廣泛應用地位。所以，豬冷凍精液技術在未來養(yǎng)豬業(yè)中的普遍應用的價值仍存在不斷地爭議之處。三、冷凍保存方式 在一些早期研究中，豬的精子采用玻璃瓶(Polge 1956)或玻璃試管(Settergren 1958) 和較高濃度的甘油溶液進行冷凍保存。后來，牛的粒狀干冰方法被應用到豬上(Nagase and Niwa 1963)，把甘油溶液濃度降到1~3%的范圍，可以執(zhí)行快速冷凍降溫操作 (Purse1 and Johnson 1975)。公豬精子采用5ml大容量保存 (Westendorf et a1 1975), 4-5 ml 鋁袋(Waide et a1 1975), 0.5 ml 中型細管 (Fazano 1986, Baron 1986, Leps 1988), 1.7-2.0 mL 扁平大容量細管(Leps 1988, Moura 1988, Ewert 1988, Stampa 1989, Wegmann 1990, Simmet 1993), 和 0.25 mL 微型細管, 和不同類型的5 mL 塑料袋 (Larsson et a1 1976, 1991b, Mwanza and Rodriguez-Martinez 1993, 1996)。所有這些保存類型既有它的優(yōu)點又有它的缺點。顆粒和0.25 、0.5 mL小型細管有較大的表面積/容量比，是適合低溫冷凍保存的形狀。然而顆粒的冷凍精液較難進行不同頭份/來源的區(qū)別，容易造成交叉污染且不易解凍。1頭份一般需要解凍10-20 根小型細管或2-3 根扁平細管，這是造成普遍推廣應用的首要障礙。5 mL 的大型細管具有1頭份的精子數(shù)量，但其表面積/容量比較小，限制了理想的冷凍和解凍過程(Weitze et a1 1987)。對塑料袋包裝的測試結果一直表明能均勻地冷凍和解凍，并含有1頭份精子數(shù)量，但其體積太大，不適合放置在液氮罐里保存，因此無法采用。雖然5 mL大型細管Maxi-straw保存精子解凍后活力略低，但在實踐中易于操作，比顆粒的使用更加廣泛(Almlid and Hofmo 1996), 主要原因是不會引起交叉污染和在使用現(xiàn)場
更方便解凍。一些學者證實：微型、小型、中型細管，扁平細管和塑料袋保存的凍精樣品經(jīng)解凍后，比大型細管在精子直線運動、頂體完整性、活力方面均表現(xiàn)得更加優(yōu)良(詳見Simmet 1993綜述)。大型細管Maxi-straw保存的精子活力低主要原因是位于細管中間的精子受冷不均勻，但從受精率考慮，活力并不是決定性因素，因為一些學者報道了大型、中型、扁平的大型細管保存的凍精受精率無明顯的差異(Fazano 1986 and Stampa 1989)。盡管資料顯示利用扁平細管或5 ml塑料袋保存的凍精與大型細管Maxi-straws相比有更高的受精力、輸卵管富余精子更多，但這些保存方法在生產(chǎn)實踐中均沒有被推廣使用(Simmet 1993) (Bwanga et a11991b)。在目前的實踐應用中，仍以傳統(tǒng)的顆粒或細管凍精為基礎。
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