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感謝大夫?yàn)槲铱焖俳獯稹撊绾沃委熀头乐?/p>
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摘 要：通過(guò)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、乙型腦炎病毒等的基因序列分析，設(shè)計(jì)多聯(lián)PCR診斷方法診斷發(fā)病豬場(chǎng)上述病毒的混合感染，發(fā)現(xiàn)單病毒感染率在68.7%～81.5%之間，混合感染率在58.9%～90%之間。采取的防制措施是研制和普遍使用新型疫苗，嚴(yán)防病原體傳入，撲殺危險(xiǎn)患病豬只，封閉式飼養(yǎng)等綜合性措施，獲得了較好的效果。關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；豬“高熱病”；多聯(lián)PCR 近年，在我國(guó)不少規(guī)�；i場(chǎng)以繁殖障礙為主要癥狀的豬病毒性疾病時(shí)有發(fā)生，尤其是2006年夏季發(fā)生的“豬高熱病”，有專家稱[1-2]其中繁殖障礙性病原起著重要的作用，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起豬繁殖障礙性疾病的病原體比較多，其中豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，豬繁殖與呼吸綜合征病病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis B virus，JEV)，偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等病原體對(duì)規(guī)�；i場(chǎng)的影響最為嚴(yán)重[3]。該類疫病發(fā)病后的主要臨床癥狀為妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、畸形胎、產(chǎn)弱仔和長(zhǎng)期不發(fā)情或?qū)遗洳辉�，有時(shí)以高熱為主等。在感染豬群中，PRRSV、CSFV、JEV和PPV等混合感染的現(xiàn)象非常普遍[4-5]，有的是兩種病原混合感染，有的甚至是3種以上病原混合感染，給診斷和防治帶來(lái)了困難。傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法，如病毒間接熒光抗體反應(yīng)，瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，或病毒的分離鑒定等都存在著繁瑣、耗時(shí)、特異性差等缺點(diǎn)。如果用單項(xiàng)RT-PCR進(jìn)行診斷仍然需要多次診斷才能得出結(jié)果，因此，需要一種特異、快速、一次可以診斷多種病原的診斷方法。用多聯(lián)PCR則能比較好的解決這一問(wèn)題。多聯(lián)PCR技術(shù)是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)擴(kuò)增的方法[5-6]，我們參照文獻(xiàn)[5-6]，設(shè)計(jì)了幾對(duì)引物，對(duì)發(fā)生在江蘇、河南、山東等一些規(guī)�；i場(chǎng)的可疑病例的病料進(jìn)行了檢測(cè)和分析，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 試劑與待檢病料dNTPs，Taq酶為Promega公司產(chǎn)品。DNA Marker為DL 2 000，TECH寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，PCR儀(PTC-225)為美國(guó)MJ公司產(chǎn)品。待檢病料由江蘇、山東、河南等省幾個(gè)規(guī)�；i場(chǎng)中發(fā)生的繁殖障礙和呼吸障礙病例中采集的可疑病料。參考毒株及試劑由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所何孔旺研究員提供。1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)基因庫(kù)提供的病毒序列和已發(fā)表的PRRSV、CSFV和JEV的序列，參照文獻(xiàn)[5-7]，針對(duì)CSFV E2基因(囊膜糖蛋白gp55基因)，PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白基因和JEV多聚蛋白的基因序列(表1)設(shè)計(jì)引物。根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)的原則[8]，參考文獻(xiàn)[9-14]，對(duì)PRRSV、JEV已知的病毒基因組，利用Hitachi DNAsis軟件進(jìn)行同源性分析，選擇同源性高的區(qū)域或病毒保守區(qū)域作為病毒基因組擴(kuò)增靶序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。在單項(xiàng)PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，利用VNT130軟件進(jìn)行各病毒引物與其他病毒引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，避免形成穩(wěn)定二聚體。還要注意3對(duì)引物中每條引物與其他引物間不能有5個(gè)堿基以上的互補(bǔ)區(qū)。 表1 多重PCR引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度以及開(kāi)放閱讀框中位置Table 1 Sequences of PCR primers，product sizes and location within ORFs病毒基因Virus gene引物Primers引物序列(5′～3′)Sequences of primers位置Site in genome產(chǎn)物長(zhǎng)度/bplength退火溫度/℃Annealing temperatureCSFVCSFV-P1GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG5 077～5 58550861.5CSFV-P2TGATGCTGTCACACAGGTGAA55.6JEVJEV-P1CGGACCAGGCATTCCAAGCGAAG723～1 10638062.1JEV-P2GACGTCCAATGTTGGTTTGTCG58.1PRRSVPRRS-P1ATGCTTTCACGGAGTTCTTGG12 111～12 37326355.9PRRS-P2AGGGTTGACACCTTATGG60.41.3 病料的處理和RNA的提取取采自病豬的肺、脾、肝、淋巴結(jié)、扁桃體等組織臟器于勻漿器內(nèi)勻漿，加入變性液與之作用。按異硫氰酸胍、酚、氯仿一步法[7,15]進(jìn)行，即將上述作用液置1.5 mL的離心管內(nèi)，在混旋儀上混勻2 min，加醋酸鈉(pH 4.0)溶液50 μL，混勻，再加入0.6 mL苯酚∶氯仿∶異戊醇(50∶49∶1)混合液，混合后冰浴15 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。取水相加等體積異丙醇混勻，置－20 ℃ 1 h，沉淀RNA。在4 ℃以12 000 r/min離心25 min。其沉淀再用0.1 mL變性溶液重新溶解，加入等體積的異丙醇混勻，置－20 ℃沉淀1 h。4 ℃ 12 000 r/min離心25 min，其沉淀即為RNA。用750 mL/L乙醇晃蕩洗滌1次，棄乙醇，置室溫吹干，備用。1.4 RT-PCR1.4.1 合成cDNA第一鏈 取上述總RNA 10 μL， 25 pmol/L P21 μL，混勻后置70 ℃水浴10 min， 然后立即冰浴5 min，再加5ⅹRT緩沖液 (250 mmol/L pH8.3 Tris-HCl,250 mmol/L KCl,50 mmol MgCl2,50 mmol/L DTT， 2.5 mol/L魚(yú)子精)6 μL，dNTPS(各含2.5 mg/ L)1.5 μL，RNasin 1 μL (40 U)， AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL(9 U)，最后加雙蒸餾水至30 μL�；靹蚝笾�42 ℃作用1 h，然后于94 ℃作用5 min，立即冰浴5 min。1.4.2 PCR PCR總體積為50 μL，取10 μL RT產(chǎn)物置0.5 mL離心管中，依次加入10×PCR buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL(25 pmol/ L)，加雙蒸餾水至50 μL， 95 ℃變性5 min，立即冰浴5 min，然后加入Taq DNA聚合酶0.5 μL(2.5 U)，混合后進(jìn)行PCR循環(huán)。擴(kuò)增CSFV、PRRSV和JEV基因片段的設(shè)置參數(shù)為：94 ℃ 1 min， 58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35循環(huán)，然后72 ℃延伸7 min。PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析擴(kuò)增片段。1.5 擴(kuò)增片段的測(cè)序分析將部分RT-PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(上海華瞬生物工程公司產(chǎn)品)純化后直接進(jìn)行測(cè)序，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行。然后用DNA Star軟件進(jìn)行序列同源性分析。2 結(jié)果2.1 CSFV檢測(cè)用RT-PCR方法擴(kuò)增出了508 bp的核酸條帶，與陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果相符
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摘 要：通過(guò)對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、乙型腦炎病毒等的基因序列分析，設(shè)計(jì)多聯(lián)PCR診斷方法診斷發(fā)病豬場(chǎng)上述病毒的混合感染，發(fā)現(xiàn)單病毒感染率在68.7%～81.5%之間，混合感染率在58.9%～90%之間。采取的防制措施是研制和普遍使用新型疫苗，嚴(yán)防病原體傳入，撲殺危險(xiǎn)患病豬只，封閉式飼養(yǎng)等綜合性措施，獲得了較好的效果。關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；豬“高熱病”；多聯(lián)PCR 近年，在我國(guó)不少規(guī)模化豬場(chǎng)以繁殖障礙為主要癥狀的豬病毒性疾病時(shí)有發(fā)生，尤其是2006年夏季發(fā)生的“豬高熱病”，有專家稱[1-2]其中繁殖障礙性病原起著重要的作用，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。引起豬繁殖障礙性疾病的病原體比較多，其中豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，豬繁殖與呼吸綜合征病病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis B virus，JEV)，偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)，豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)等病原體對(duì)規(guī)�；i場(chǎng)的影響最為嚴(yán)重[3]。該類疫病發(fā)病后的主要臨床癥狀為妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、畸形胎、產(chǎn)弱仔和長(zhǎng)期不發(fā)情或?qū)遗洳辉校袝r(shí)以高熱為主等。在感染豬群中，PRRSV、CSFV、JEV和PPV等混合感染的現(xiàn)象非常普遍[4-5]，有的是兩種病原混合感染，有的甚至是3種以上病原混合感染，給診斷和防治帶來(lái)了困難。傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法，如病毒間接熒光抗體反應(yīng)，瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)，或病毒的分離鑒定等都存在著繁瑣、耗時(shí)、特異性差等缺點(diǎn)。如果用單項(xiàng)RT-PCR進(jìn)行診斷仍然需要多次診斷才能得出結(jié)果，因此，需要一種特異、快速、一次可以診斷多種病原的診斷方法。用多聯(lián)PCR則能比較好的解決這一問(wèn)題。多聯(lián)PCR技術(shù)是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，對(duì)多個(gè)目的基因同時(shí)擴(kuò)增的方法[5-6]，我們參照文獻(xiàn)[5-6]，設(shè)計(jì)了幾對(duì)引物，對(duì)發(fā)生在江蘇、河南、山東等一些規(guī)�；i場(chǎng)的可疑病例的病料進(jìn)行了檢測(cè)和分析，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 試劑與待檢病料dNTPs，Taq酶為Promega公司產(chǎn)品。DNA Marker為DL 2 000，TECH寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，PCR儀(PTC-225)為美國(guó)MJ公司產(chǎn)品。待檢病料由江蘇、山東、河南等省幾個(gè)規(guī)�；i場(chǎng)中發(fā)生的繁殖障礙和呼吸障礙病例中采集的可疑病料。參考毒株及試劑由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所何孔旺研究員提供。1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)基因庫(kù)提供的病毒序列和已發(fā)表的PRRSV、CSFV和JEV的序列，參照文獻(xiàn)[5-7]，針對(duì)CSFV E2基因(囊膜糖蛋白gp55基因)，PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白基因和JEV多聚蛋白的基因序列(表1)設(shè)計(jì)引物。根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)的原則[8]，參考文獻(xiàn)[9-14]，對(duì)PRRSV、JEV已知的病毒基因組，利用Hitachi DNAsis軟件進(jìn)行同源性分析，選擇同源性高的區(qū)域或病毒保守區(qū)域作為病毒基因組擴(kuò)增靶序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。在單項(xiàng)PCR引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，利用VNT130軟件進(jìn)行各病毒引物與其他病毒引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，避免形成穩(wěn)定二聚體。還要注意3對(duì)引物中每條引物與其他引物間不能有5個(gè)堿基以上的互補(bǔ)區(qū)。 表1 多重PCR引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度以及開(kāi)放閱讀框中位置Table 1 Sequences of PCR primers，product sizes and location within ORFs病毒基因Virus gene引物Primers引物序列(5′～3′)Sequences of primers位置Site in genome產(chǎn)物長(zhǎng)度/bplength退火溫度/℃Annealing temperatureCSFVCSFV-P1GCTCCTGGTTGGTAACCTCGG5 077～5 58550861.5CSFV-P2TGATGCTGTCACACAGGTGAA55.6JEVJEV-P1CGGACCAGGCATTCCAAGCGAAG723～1 10638062.1JEV-P2GACGTCCAATGTTGGTTTGTCG58.1PRRSVPRRS-P1ATGCTTTCACGGAGTTCTTGG12 111～12 37326355.9PRRS-P2AGGGTTGACACCTTATGG60.41.3 病料的處理和RNA的提取取采自病豬的肺、脾、肝、淋巴結(jié)、扁桃體等組織臟器于勻漿器內(nèi)勻漿，加入變性液與之作用。按異硫氰酸胍、酚、氯仿一步法[7,15]進(jìn)行，即將上述作用液置1.5 mL的離心管內(nèi)，在混旋儀上混勻2 min，加醋酸鈉(pH 4.0)溶液50 μL，混勻，再加入0.6 mL苯酚∶氯仿∶異戊醇(50∶49∶1)混合液，混合后冰浴15 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。取水相加等體積異丙醇混勻，置－20 ℃ 1 h，沉淀RNA。在4 ℃以12 000 r/min離心25 min。其沉淀再用0.1 mL變性溶液重新溶解，加入等體積的異丙醇混勻，置－20 ℃沉淀1 h。4 ℃ 12 000 r/min離心25 min，其沉淀即為RNA。用750 mL/L乙醇晃蕩洗滌1次，棄乙醇，置室溫吹干，備用。1.4 RT-PCR1.4.1 合成cDNA第一鏈 取上述總RNA 10 μL， 25 pmol/L P21 μL，混勻后置70 ℃水浴10 min， 然后立即冰浴5 min，再加5ⅹRT緩沖液 (250 mmol/L pH8.3 Tris-HCl,250 mmol/L KCl,50 mmol MgCl2,50 mmol/L DTT， 2.5 mol/L魚(yú)子精)6 μL，dNTPS(各含2.5 mg/ L)1.5 μL，RNasin 1 μL (40 U)， AMV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL(9 U)，最后加雙蒸餾水至30 μL�；靹蚝笾�42 ℃作用1 h，然后于94 ℃作用5 min，立即冰浴5 min。1.4.2 PCR PCR總體積為50 μL，取10 μL RT產(chǎn)物置0.5 mL離心管中，依次加入10×PCR buffer 5 μL， dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL(25 pmol/ L)，加雙蒸餾水至50 μL， 95 ℃變性5 min，立即冰浴5 min，然后加入Taq DNA聚合酶0.5 μL(2.5 U)，混合后進(jìn)行PCR循環(huán)。擴(kuò)增CSFV、PRRSV和JEV基因片段的設(shè)置參數(shù)為：94 ℃ 1 min， 58 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35循環(huán)，然后72 ℃延伸7 min。PCR結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，分析擴(kuò)增片段。1.5 擴(kuò)增片段的測(cè)序分析將部分RT-PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒(上海華瞬生物工程公司產(chǎn)品)純化后直接進(jìn)行測(cè)序，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行。然后用DNA Star軟件進(jìn)行序列同源性分析。2 結(jié)果2.1 CSFV檢測(cè)用RT-PCR方法擴(kuò)增出了508 bp的核酸條帶，與陽(yáng)性對(duì)照的結(jié)果相符
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