臨床生物化學(xué):第二節(jié)　酶活性測(cè)定的常用技術(shù)和方法

從廣義上說(shuō)，任何一種可以測(cè)定反應(yīng)物變化速度的分析技術(shù)，不論是經(jīng)典的比色法、容量法，還是現(xiàn)代的儀器分析技術(shù)都可用來(lái)測(cè)定酶活性濃度，但從歷史和發(fā)展m.bhskgw.cn來(lái)看，主要還是使用分光亮度法和量氣法。

一、量氣法

在封閉的反應(yīng)系統(tǒng)中如有氣體變化，通過(guò)測(cè)量變化后的氣體體積或壓力很容易計(jì)算出氣體變化量，這是量氣法的基本原理。曾在檢驗(yàn)科廣泛應(yīng)用的Van-slyke測(cè)二氧化碳結(jié)合力的方法就是量氣法的一個(gè)典型例子。Warburg進(jìn)一步加以發(fā)展，設(shè)計(jì)出專用于測(cè)定酶活性的華勃呼吸儀。這種儀器特別適用于測(cè)定那些在反應(yīng)中產(chǎn)生或消耗氣體的酶，例如氧化酶反應(yīng)涉及到O₂的消耗，脫羧m.bhskgw.cn/Article/酶會(huì)產(chǎn)生CO₂。但也不僅限于這些酶，科學(xué)家采用與CO₂氣體保持平衡過(guò)的重碳酸鹽體系，可用來(lái)測(cè)定各種產(chǎn)生H⁺的酶反應(yīng)，如各種還原酶，可使NADH變?yōu)镹AD和H⁺，而H⁺會(huì)促使反應(yīng)體系中重碳酸鹽變?yōu)镃O₂氣體。

二、比色法與分光亮度法

在20世紀(jì)上半個(gè)世紀(jì)華勃儀得到研究實(shí)驗(yàn)室廣泛的應(yīng)用，并在酶學(xué)上得到豐碩的成果。但此法操作煩瑣，技術(shù)要求高而且靈敏度低。臨床常規(guī)中很少使用。多使用簡(jiǎn)單易行的比色法測(cè)酶活性。在上半個(gè)世紀(jì)建立了一些適用于常規(guī)工作的測(cè)酶活性濃度的方法，如測(cè)定淀粉酶的Somogyi法，堿性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。這些方法都是在酶和底物作用一段時(shí)間后停止酶反應(yīng)，加入各種化學(xué)試劑與產(chǎn)物或基質(zhì)反應(yīng)呈色，用比色計(jì)在可見(jiàn)光處比色，同時(shí)將被測(cè)物質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較后計(jì)算出在此段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物生成量或底物消耗量，從而求得反應(yīng)速率v。

比色法從50年代起逐步被分光光度法所取代。這是因?yàn)榉止夤舛确ㄓ幸韵聨讉�(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)：一是測(cè)定范圍不只局限在可見(jiàn)光，還可擴(kuò)展到紫外和紅外部分。這就為擴(kuò)大測(cè)定酶范圍提供了可能性。二是提供了尋找一類不需停止酶反應(yīng)就可直接測(cè)定產(chǎn)物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反應(yīng)A－＞B＋C，A、B、C三種物質(zhì)用分光光度法的吸收光譜如圖17-1所示。

圖17-1　A、B、C三種物質(zhì)的吸收曲線

可以看到C在560nm處有一吸收峰，而A和B在此處無(wú)吸光度變化因此無(wú)需停止酶反應(yīng)，只要在560nm處測(cè)定吸光度變化就很容易計(jì)算出C的變化速度，而且C物質(zhì)比A、B二物質(zhì)有更高的吸收峰，即靈敏度最高。

這類方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P)H和NAD（P)吸收光譜差異建立的測(cè)酶活性濃度方法。NAD（P)H在340nm處有一吸收峰，而NAD（P)在此波段卻毫無(wú)吸光性。因此建立了一類和原來(lái)比色法截然不同方法。不需停止酶反應(yīng)，在340nm根據(jù)吸光度變化，就可觀察到酶反應(yīng)變化全過(guò)程。

第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不需要如比色法那樣，作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，因?yàn)榉止夤舛扔?jì)使用近似單色光的光源，在此條件下，某一特定物質(zhì)的吸光度為常數(shù)，即人們所熟悉的摩爾吸光度（molar absorbance)。根據(jù)此值從吸光度△A/△T不難計(jì)算出酶催化反應(yīng)速度v。

分光光度計(jì)的這些簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)使它在近年來(lái)已逐步取代比色法而成為目前最流行的方法。其缺點(diǎn)是需要精確帶恒溫裝置的分光光度計(jì)，在經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)尚難推廣。

分光光度法的技術(shù)多樣化。設(shè)計(jì)得當(dāng)可用于各種酶的測(cè)定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化還原物質(zhì)特性。

除了前述的NAD(P)H系統(tǒng)可用于脫氫酶測(cè)定外，可利用黃素單核苷酸（FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)來(lái)測(cè)定各種含這二個(gè)輔基的酶。它們的氧化型在450nm有一很強(qiáng)吸收峰，而還原型的吸光度很低，同樣細(xì)胞色素還原型在可見(jiàn)光有一個(gè)非常明顯和很窄的吸收峰，都使人們很容易用分光光度法研究這些酶的作用。上述物質(zhì)主要用于氧化還原酶的測(cè)定。

科學(xué)家還設(shè)計(jì)出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法測(cè)定。例如合成了很多對(duì)硝基酚的衍生物，用于各種水解酶的測(cè)定。堿性磷酸酶底物磷酸對(duì)硝基酚就是一個(gè)成功例子。又如測(cè)芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸對(duì)硝基酚為底物，其分解產(chǎn)物的吸收峰由原來(lái)的278nm變?yōu)?18nm，Webb成功地在330nm進(jìn)行此酶監(jiān)測(cè)。

表17-2　一些氧化還原物質(zhì)的特性

分光光度法的上述原理還可以用于其它酶的測(cè)定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不飽和鍵，在330nm處有很強(qiáng)吸收峰，而酶作用產(chǎn)物無(wú)此不飽和鍵。則不難在330nm處對(duì)這些酶進(jìn)行直接測(cè)定。

此后在分光光度法的發(fā)展過(guò)程中又導(dǎo)入了酶偶聯(lián)技術(shù)。使得分光光度法幾乎能測(cè)定所有的酶。因此臨床實(shí)驗(yàn)室工作者如不能很好掌握分光光度法的技術(shù)，不了解各種影響因素，要作好酶的測(cè)定是很困難的。

三、熒光法和同位素法

分光亮度法有一個(gè)缺點(diǎn)，即靈敏度較低。有些標(biāo)本中酶濃度很低時(shí)往往測(cè)不出來(lái)。此時(shí)可考慮改用熒光法，可將測(cè)定靈敏度提高2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。如科學(xué)家合成了一系列甲基傘形酮的衍生物，可取代對(duì)硝基酚衍生物做為一些水解酶的底物，由于水解產(chǎn)物甲基傘形酮有強(qiáng)烈熒光，大大提高測(cè)定的靈敏度，就是分光亮度法中最常用的NAD(P)H反應(yīng)系統(tǒng)，也可改用熒光法，在340nm紫外線激發(fā)下NAD(P)H產(chǎn)生強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，而NAD(P)不被激發(fā)。此外，還可使用在熒光法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的時(shí)間分辨熒光法，例如北京醫(yī)院就曾利用此種靈敏度極高方法測(cè)定很難用其它方法檢測(cè)的腦脊液中微量的烯醇化酶。熒光法不易掌握，對(duì)所用的試劑、容器和儀器都要求很高，否則易產(chǎn)生非特異熒光干擾測(cè)定，或者引起熒光的淬滅使測(cè)定不準(zhǔn)，故此種方法多用于研究實(shí)驗(yàn)室，少用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。為提高靈敏度，還可使用同位素標(biāo)記的底物進(jìn)行酶測(cè)定，例如，有人以C12標(biāo)記的乙酰膽堿為底物測(cè)定膽堿酯酶，在酶作用后以離子交換法分離出含C14的乙酸。同位素方法由于對(duì)人體有害，操作麻煩，目前已很少使用。

四、其它方法

離子選擇電極法，旋光法等有時(shí)用于測(cè)定特定的酶，當(dāng)酶反應(yīng)牽涉到有酸堿變化時(shí)，很容易用pH儀直接觀察酶反應(yīng)過(guò)程中H⁺的變化。直接用pH儀測(cè)酶反應(yīng)有兩個(gè)缺點(diǎn)：一是隨pH變化，會(huì)偏離酶作用的最適pH值，不可避免地引起酶反應(yīng)速度變慢。其二是如測(cè)定的標(biāo)本不是純酶時(shí)標(biāo)本中其他蛋白及其它有緩衡能力的物質(zhì)將會(huì)影響所測(cè)pH變化的程度。此時(shí)如改用電位滴定儀則更為適合。此儀器可在酶反應(yīng)過(guò)程中不斷向反應(yīng)體系中加入酸或堿以維持反應(yīng)體系pH的恒定，而加入的酸堿量只與體系中H⁺變化量相關(guān)，和反應(yīng)體系中緩衡能力無(wú)關(guān)。

同樣如酶反應(yīng)中有O₂變化，可使用氧電極來(lái)監(jiān)測(cè)酶反應(yīng)過(guò)程，這可用來(lái)測(cè)定葡萄糖氧化酶活性，Chappell還成功地將此技術(shù)用于測(cè)線粒體的氧化能力。還曾有人嘗試用二氧化碳和氨電極測(cè)酶，由于這些電極反應(yīng)時(shí)間較慢，不利于檢測(cè)酶反應(yīng)速度。有些酶的反應(yīng)物為光學(xué)異構(gòu)體，則可根據(jù)旋光度變化來(lái)追蹤酶反應(yīng)。某些反應(yīng)物如羥基酸本身雖無(wú)旋光性，但與鉬結(jié)合后產(chǎn)生很高的旋光性。根據(jù)此特性建立了測(cè)定延胡索酸水合酶的方法。還有個(gè)別酶的測(cè)定使用了極譜法、高效液相色譜法等�？傊�，實(shí)驗(yàn)室工作者完全可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和技術(shù)，創(chuàng)造性地建立一些新的測(cè)活性濃度的方法。