實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié)　分子克隆載體

載體（vector)是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。因此，作為載體應(yīng)該滿足以下幾方面m.bhskgw.cn/wszg/的要求：①有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)；②外源DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無害，以及載體能接納盡可能大的外源DNA片段；③有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出；④具有促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。

重組DNA技術(shù)中最常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體λ，柯斯質(zhì)粒（cosmid)和噬菌體M13。它們的受體細(xì)胞都是大腸桿菌。這四種載體的大小和結(jié)構(gòu)盡管各不相同，但它們的共同特點(diǎn)是：①都能在大腸桿菌中自主復(fù)制，而且m.bhskgw.cn/hushi/能連同所帶的外源DNA一起復(fù)制；②都很容易同細(xì)菌DNA分開并加以純化；③都有一段DNA對(duì)于它們自身在細(xì)菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入這一段DNA中，或是置換這一段DNA而不影響載體的復(fù)制。根據(jù)這一特點(diǎn)，載體又可分成插入型和置換型兩大類。

一、質(zhì)粒

質(zhì)粒（plasmid)是許多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的染色體外的遺傳因子，它是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小從1kb直到200kb以上。質(zhì)粒所帶的基因通常有利于宿主細(xì)胞。例如基因的產(chǎn)物是某些抗生素或?qū)δ承┛股�素的抗性、能降解某些�?fù)雜的有機(jī)化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素、產(chǎn)生限制酶或修飾酶等。

在天然條件下，許多種質(zhì)粒是通過類似于細(xì)菌接合的過程傳遞給新的宿主。在實(shí)驗(yàn)室條件下，質(zhì)粒則可通過轉(zhuǎn)化過程進(jìn)入受體細(xì)胞。此時(shí)，受體細(xì)胞已經(jīng)過處理而處于感受態(tài)，即它的細(xì)胞暫時(shí)易于讓小的DNA分子透過。受體細(xì)胞由于質(zhì)粒的進(jìn)入而產(chǎn)生了新的表型。如對(duì)某種抗生素的抗性，這樣就可用這種抗生素作為選擇條件，選出被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞。

質(zhì)粒復(fù)制時(shí)利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身染色體的同一組酶系。有些質(zhì)粒處于“嚴(yán)緊控制”之下，即它們的復(fù)制是同宿主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步的。因此在每個(gè)細(xì)胞中的質(zhì)粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴(yán)緊型”質(zhì)粒。另一些質(zhì)粒則是處于“松弛控制”之下的“松弛型”質(zhì)粒。每個(gè)細(xì)菌中可以有10～200份拷貝。更重要的是松弛型質(zhì)粒的拷貝數(shù)，可因宿主細(xì)胞停止合成蛋白質(zhì)而增加至幾千份。宿主細(xì)胞不合成蛋白質(zhì)時(shí)，染色體和嚴(yán)緊型質(zhì)粒的復(fù)制都中止。但松弛型質(zhì)粒仍繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制。因此在增殖松弛型質(zhì)粒時(shí)，總是要讓宿主菌經(jīng)氯霉素處理（在培養(yǎng)液中加入適量的氯霉素)抑制蛋白質(zhì)的合成。

圖23-3　pBR322的基本結(jié)構(gòu)

（一)大腸桿菌質(zhì)粒

應(yīng)用的最廣泛的質(zhì)粒載體是pBR322，它屬松弛型質(zhì)粒，有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個(gè)抗性基因可作為標(biāo)記基因，有許多種常用的限制酶的切點(diǎn)。它全長4352個(gè)核苷酸，排列順序已全部測(cè)定，基本結(jié)構(gòu)如圖23-3。

當(dāng)需要用pBR322來克隆BamHI酶切的一個(gè)DNA片段時(shí)，一般的做法是如圖23-4所示。

圖23-4　pBR322克隆DNA片段的程序

從圖23-4可見，外源DNA片段同pBR322都經(jīng)Bam HⅠ酶切，所以有相同的單鏈“粘性末端”，通過DNA連接酶可以構(gòu)成重組DNA分子。由于pBR322的BamHⅠ酶切點(diǎn)在四環(huán)素的抗性基因中，所以Bam HⅠ酶切后使這個(gè)抗性基因失活。如果酶切后的質(zhì)粒pBR322自身又重新連接，則恢復(fù)對(duì)四環(huán)素的抗性，轉(zhuǎn)化子就仍然具有對(duì)二種抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA，則轉(zhuǎn)化子失去了四環(huán)素抗性表型，而只有對(duì)氨芐青霉素的抗性，這樣就可根據(jù)轉(zhuǎn)化子的抗性而把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌選出，然后擴(kuò)增細(xì)菌，大量回收質(zhì)粒DNA，從而達(dá)到大量擴(kuò)增外源DNA的目的。

（二)真核生物中的質(zhì)粒

真核生物中的酵母是國內(nèi)外廣泛研究的載體-受體系統(tǒng)之一。這是一個(gè)共價(jià)閉環(huán)DNA分子（cccDNA)，平均周長2μm，所以稱為2μm DNA質(zhì)粒，在每個(gè)酵母細(xì)胞里約有100個(gè)拷貝。已有人把2μm DNA同pBR322 DNA構(gòu)建成雙功能質(zhì)粒，可在大腸桿菌和酵母菌中復(fù)制。這種質(zhì)粒帶有啤酒酵母的二個(gè)基因（his 3和Leu 2)，所以很容易用酵母的營養(yǎng)缺陷型菌株來選出。

二、噬菌體和病毒載體

噬菌體λ是最主要的一種載體。自從1974年以來，已用野生型λ改造和構(gòu)建出一系列噬菌體載體。

噬菌體λ是溫和噬菌體�；�因組是長約50kb的雙鏈DNA分子。在噬菌體λ顆粒中，DNA是線狀雙鏈分子帶有單鏈的互補(bǔ)末端。末端長12個(gè)核苷酸，這稱為粘性末端，簡寫COS。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后，雙鏈DNA分子通過COS而成環(huán)狀。在感染早期，環(huán)狀DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在此期間，噬菌體有兩條復(fù)制途徑可供選擇：一是裂解生長。環(huán)狀DNA分子在宿主細(xì)胞里復(fù)制若干次，合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物，形成子代噬菌體顆粒，成熟后使細(xì)菌裂解，釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長。噬菌體DNA整合進(jìn)宿主菌的基因組，然后象細(xì)菌染色體上的基因一樣進(jìn)行復(fù)制，并傳遞給下一代細(xì)菌。

（一)噬菌體λ載體的構(gòu)建

野生型噬菌體λDNA全長約50kb，上有65種限制酶酶切點(diǎn)，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個(gè)切點(diǎn)外，其余都多于2個(gè)。有些酶切點(diǎn)在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體λ必須經(jīng)過改造才能用作載體�，F(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點(diǎn)。因此，作為載體的噬菌體λ都短于野生型。

噬菌體λ載體有兩種類型：①插入型。由于改建后的噬菌體λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長，插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個(gè)區(qū)域，左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個(gè)成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個(gè)區(qū)域約長12kb。中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會(huì)影響噬菌體λ裂解生長的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。

噬菌體λ裂解生長的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關(guān)。當(dāng)DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。

置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后，要設(shè)法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因?yàn)樽蟊酆陀冶叟c中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復(fù)的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍(lán)色噬菌斑試驗(yàn)。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當(dāng)這種噬菌體感染lac宿主細(xì)胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)的培養(yǎng)基上生長時(shí)，半乳糖苷酸與Xgal反應(yīng)的產(chǎn)物為不溶性的靛藍(lán)染料。因此，含有中間片段的重新恢復(fù)的噬菌體形成藍(lán)色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無色透明的。

（二)單鏈?zhǔn)删�體載體

最常用的單鏈?zhǔn)删�體載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體，有長約6500個(gè)核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細(xì)菌，即F’或Hfr細(xì)菌。當(dāng)噬菌體進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，單鏈的噬菌體DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型（RF)。從細(xì)胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當(dāng)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞里積聚了200到300份RF型拷貝時(shí)，M13開始不對(duì)稱的合成，即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒，顆粒不斷地從感染細(xì)胞上芽生。M13感染雖不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長受到一定的抑制，所以形成混濁的噬菌斑。

M13的基因組中除有一段507個(gè)核苷酸，其余都含有與其復(fù)制有關(guān)的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點(diǎn)是從細(xì)菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，其中包含了克隆DNA片段的二條互補(bǔ)鏈中的一條，因此可用來作為對(duì)DNA測(cè)序的模板。另外，可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補(bǔ)的RNA。M13的RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的識(shí)別和切割，克隆進(jìn)雙鏈的外源DNA。從細(xì)菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA。問題是插入M13的外源DNA超1000bp時(shí)就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時(shí)會(huì)出現(xiàn)缺失。一般說，插入300～400bp是相當(dāng)穩(wěn)定的。

（三)猴病毒40（SV40)

猴病毒40（SV40)的基因組常用來作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞。猴病毒40是球形動(dòng)物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側(cè)順序)整合在SV40中后，在被感染的猴腎細(xì)胞中都能正確地轉(zhuǎn)錄和翻譯。表明猴腎細(xì)胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本。

可是，SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達(dá)；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關(guān)，使用時(shí)有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。

（四)逆轉(zhuǎn)錄病毒

逆轉(zhuǎn)錄病毒是RNA病毒，它有三個(gè)基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉(zhuǎn)錄病毒還帶有癌基因（vonc)，即有的逆轉(zhuǎn)錄病毒有致癌作用。近年來，已設(shè)計(jì)構(gòu)建成一些缺陷型病毒（defective virus)使逆轉(zhuǎn)錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉(zhuǎn)入了人體造血前體細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識(shí)別外殼蛋白進(jìn)行包裝的信號(hào)（一段尚未鑒定的DNA順序)。用這種缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒去感染某種細(xì)胞株，這種細(xì)胞株包含有輔助病毒（helpervirus)。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識(shí)別蛋白外殼進(jìn)行包裝的信號(hào)，因此它不能包裝成病毒顆粒。當(dāng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞株后，逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA進(jìn)入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時(shí)把受感染的細(xì)胞同骨髓細(xì)胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA，進(jìn)入骨髓細(xì)胞，病毒DNA插入宿主細(xì)胞基因組，基因的活性得到表達(dá)。這時(shí)，由于骨髓細(xì)胞里面沒有輔助病毒，所以整合進(jìn)宿主基因組的逆轉(zhuǎn)錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細(xì)胞分裂而傳給下一代子細(xì)胞。

三、柯斯質(zhì)粒

1978年Collins和Hohn構(gòu)建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid（柯斯質(zhì)粒)。它是用正常的質(zhì)粒同噬菌體λ的cos位點(diǎn)構(gòu)成。例如，柯斯質(zhì)粒pHC79系由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成（圖23-5)，全長43.kb。在包裝時(shí)，cos位點(diǎn)打開而產(chǎn)生噬菌體λ的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性兩個(gè)標(biāo)記。圖23-5說明了克隆基因時(shí)有用的限制酶切點(diǎn)。所以可以說柯斯質(zhì)粒是一類特殊的重組質(zhì)粒。

圖23-5　柯斯質(zhì)粒pHC₇₉

設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長4～6kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)�？上笫删�體λ一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。如把宿主菌在含氯霉素的培養(yǎng)基中生長，柯斯質(zhì)�？梢詳U(kuò)增到宿主細(xì)胞DNA總量的50%左右。

采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難是：①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻�二處片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。現(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。

現(xiàn)將上面提到的四種載體作一比較（表23-3)

表23-3 四種載體的比較

* 外源DNA如超過10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低

** 已有個(gè)別質(zhì)料可用于此目的

四、其他載體

現(xiàn)在提到的分子載體有的不是用于克隆某基因，而是作為外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載工具。

（一)轉(zhuǎn)座子載體

這里主要提一下有關(guān)果蠅轉(zhuǎn)座因子（P因子)作為基因載體。因?yàn)檫@是很有希望的真核生物基因工程的載體，果蠅的P因子約長3kb，每端各有反向重復(fù)順序，當(dāng)它插入基因組時(shí)，可以激活或滅活近旁的基因，當(dāng)它從基因組上切下來時(shí)，也可能把近旁的基因或DNA順序一起切下而引起突變�，F(xiàn)在已能把帶有某種限制酶切點(diǎn)的P因子克隆到質(zhì)粒pBR322中，然后在P因子酶切點(diǎn)上插入外源DNA。經(jīng)過擴(kuò)增后，將這種重組DNA用微量注射儀直接注入果蠅的受精卵中。結(jié)果所克隆的基因能隨P因子插入受體細(xì)胞的基因里，并且得到表達(dá)。

（二)人工微小染色體

包括人體在內(nèi)的高等生物基因工程中遇到的一個(gè)難題是缺乏合適的基因載體。要求載體對(duì)受體細(xì)胞沒有危害，能安全、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)給后代，使基因的性狀得到連續(xù)的表達(dá)。這對(duì)校正某種遺傳缺陷或改進(jìn)某種性狀都是十分有用的。目前一些實(shí)驗(yàn)室正致力于構(gòu)建人工微小染色體（microchromosome)。

構(gòu)建染色體應(yīng)包括：基因、復(fù)制起點(diǎn)、著絲粒和端粒。染色體上需帶有基因是不言而喻的。復(fù)制起點(diǎn)是染色體復(fù)制所不可缺少的。著絲粒保證復(fù)制后的染色體均等地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。端粒具有某種特定結(jié)構(gòu)以保證染色體的個(gè)體性。

首先，構(gòu)建的是酵母的人工微小染色體。天然的酵母染色體為150～1000kb。人工構(gòu)建的微小染色體長55kb，在細(xì)胞內(nèi)很穩(wěn)定，只是每個(gè)細(xì)胞里的拷貝數(shù)很少。比如已構(gòu)成的人工微小染色體為7～15kb，每個(gè)細(xì)胞里的拷貝數(shù)雖然增多，但不夠穩(wěn)定。

人工構(gòu)建酵母微小染色體的具體步驟見圖23-6。從圖中可以看到，先用質(zhì)粒pBR322為材料，連接酵母的標(biāo)記基因Leu2（亮氨酸)后去轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后再接上酵母染色體上分離得到的著絲粒CEN3，再去轉(zhuǎn)化大腸桿菌以增殖重組質(zhì)粒，取得下一步實(shí)驗(yàn)用的DNA。接下去是連接從酵母（真核生物)中分離得到的ARS1。ARS是指自主復(fù)制順序（autonomouslyreplicat－ing sequence)，這個(gè)順序中可能包含著復(fù)制起點(diǎn)。目前已從非洲爪蟾的線粒DNA，衣藻和煙草葉綠體和核DNA中分離ARS。最后一個(gè)步驟是接上染色體端粒。用的是四膜蟲（Te－trahymena)的rDNA末端（Tr末端)。這樣構(gòu)建成的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)斷開成為線狀重組DNA分子，可以象天然染色體一樣地復(fù)制和分離，這就是酵母線狀質(zhì)粒YLp4。

圖23-6　構(gòu)建酵母人工微小染色體的步驟