實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第五節(jié)　放射免疫分析法的建立

一、放射免疫分析的基本試劑

（一)標(biāo)準(zhǔn)品

標(biāo)準(zhǔn)品是放射免疫分析法定量的依據(jù)，由于以標(biāo)準(zhǔn)品的量用來表示被涮物質(zhì)的量，故標(biāo)準(zhǔn)品與被測物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)。應(yīng)要求高度純化。標(biāo)準(zhǔn)品除含量應(yīng)具有準(zhǔn)確性外，還應(yīng)具備穩(wěn)定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。

按實(shí)驗(yàn)要求，將標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成含不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（二)標(biāo)記物

標(biāo)記抗原應(yīng)具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標(biāo)記一次可較長時(shí)間使用，這對來之不易的抗原尤其重要；④標(biāo)記簡便、易防護(hù)。

要準(zhǔn)確測量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強(qiáng)度。所選用的標(biāo)記抗原的量，在使用¹²⁵I時(shí)達(dá)5000～15000cpm。

（三)抗體

應(yīng)選擇特異性高、親和力強(qiáng)及滴度好的抗體，用于放射免疫測定。

根據(jù)稀釋曲線，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪龋�一般以結(jié)合率為50%作為抗血清的稀釋度。

（四)B與F分離劑

以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：

活性炭2g（杭州木材廠生產(chǎn)，森工牌732型)

右旋糖酐T₂₀0.2g

加0.1mol/L PB 至100ml

電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。

（五)緩沖液

放射免疫分析技術(shù)所用的緩沖液有多種，要通過實(shí)驗(yàn)選用抗體和抗原結(jié)合最高的緩沖液。

目前最常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③巴比妥緩沖液；④Tris–HCl緩沖液；⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用最多。

在緩沖液中，除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外，還應(yīng)根據(jù)不同檢測項(xiàng)目加入下列物質(zhì)：①保護(hù)蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明膠，濃度為0.1%～0.2%，用以降低試管對抗原的非特異性吸附。②防腐劑：多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑：如測定心鈉素等肽類激素時(shí)，要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對待測物的降解；又如測定cAMP、cGMP時(shí)，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑：在測定甲狀腺激素或測定某些甾體激素時(shí)，必須加阻斷劑，使和蛋白質(zhì)相結(jié)合的激素，變?yōu)橛坞x型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白：采用二抗作B與F分離劑時(shí)，要向反應(yīng)液中加入適量與第一抗體同種動(dòng)物的正常血清。在測定不含有血漿蛋白的樣品時(shí)，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

在神經(jīng)肽的RIA時(shí)，常用PELH緩沖液，（按1000ml,pH7.6)：

0．1mol/l PB980.0ml

0.3mol/L EDTA·2Na　10.0ml

0.2%洗必泰溶液　10.0ml

溶菌酶　1.0g

二、加樣程序

由于抗原、標(biāo)記抗原和抗體三者加樣次序不同，而出現(xiàn)兩種加樣程序，分述如下：

（一)平衡飽和加樣程序

1．基本原理所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合，也不解離的平衡狀態(tài)，稱為飽和狀態(tài)，即平衡飽和。所以，有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測抗原、標(biāo)記抗原、抗體三者一起溫育。

2．加樣程序一般先加標(biāo)準(zhǔn)物或被測樣品，再加抗血清，最后加標(biāo)記物。這樣的順序是讓標(biāo)準(zhǔn)物或被測物與抗體有短暫的結(jié)合，提高抗原的競爭抑制能力。

在小分子半抗原的放射免疫分析中，標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。因此，上述加樣程序就更有必要，所以一般都采用先m.bhskgw.cn/yaoshi/加標(biāo)準(zhǔn)物或樣品和抗血清，后加標(biāo)記物。這樣測定也比較穩(wěn)定。

在大分子蛋白質(zhì)抗原的放射免疫分析中，如果是雙抗體分離法，抗原和標(biāo)記抗原與抗體三者加樣，可不分先后，有的是標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)記物、抗血清的加樣順序，但一般習(xí)慣還是標(biāo)準(zhǔn)物或血樣、抗血清、標(biāo)記物、然后混勻溫育24～48h，再加雙抗體，繼續(xù)溫育24h，使免疫反應(yīng)達(dá)到平衡。對一些多肽激素的放射免疫分析，應(yīng)用雙抗體分離法，其流程比較長，這樣的順序同樣可不分先后。

以大鼠垂體、下丘腦β-內(nèi)啡肽RIA測定程序?yàn)槔��?/p>

（1)加樣（單位μl；總反應(yīng)體積500μl)

（2)孵育：4℃，24h

（3)分離B與F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，搖勻，立即離心，去上清，測沉淀（F)的CPM數(shù)。

（二m.bhskgw.cn/hushi/)順序飽和加樣程序

1．基本原理先將標(biāo)準(zhǔn)物或血樣品與抗血清混勻，免疫反應(yīng)6～24h，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原，與抗體反應(yīng)12～24h，最后分離B與F，這稱為順序飽和分析法。

應(yīng)用順序飽和加樣，可以提高測定方法的靈敏度。Utiger在做人促甲狀腺激素（TSH)放射免疫分析時(shí)，將標(biāo)記物延至第2天加入，發(fā)現(xiàn)其靈敏度增加兩倍。如果縮短最后的溫育時(shí)間，仍可取得滿意的結(jié)果。所以一般認(rèn)為，在順序飽和加樣中，第1次溫育時(shí)間可以長，而第2次溫育時(shí)間要短，這樣可以提高靈敏度。但也有相反的意見，認(rèn)為順序飽和加樣，是使用過量抗體，會(huì)使靈敏度受到一定影響。如果使用抗體不過量，溫育時(shí)間縮短，在抗原和抗體結(jié)合未達(dá)到平衡飽和時(shí)就加入標(biāo)記物，這樣既不影響加靈敏度，反而比較穩(wěn)定，甚至可提高靈敏度。

2．加樣程序　以人血漿精氨酸加壓素RIA測定程序?yàn)槔�（直接測定)。

（1)加樣（單位μl；總反應(yīng)體積600μl)

（2)孵育：4^℃，24h。

（3)分離B與F。

無肽血漿，用于血漿的直接測定。其制備方法為：在電磁攪拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共兩管，離心、去上清。血漿5ml，倒入上述活性炭管中，加蓋，充分振蕩10min，離心，上清倒入上述另一活性炭管中，振蕩10min，再離心，取上清，即無肽血漿。血漿中的生物活性物質(zhì)被活性炭吸附而去除。

（三)計(jì)數(shù)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線與測定樣品含量

以活性炭分離B與F，沉淀計(jì)數(shù)是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm數(shù)。

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管結(jié)合（B)的cpm數(shù)及與零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合（B₀)的比（B/B₀×100%)。

用半對數(shù)紙，以標(biāo)準(zhǔn)管的B/B₀為縱座標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)管含量為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)樣品的結(jié)合率（B/B₀×100%)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出被測樣品抗原的含量，再換算成每毫升血漿含某抗原的量，或每毫克（組織濕重)含某抗原的量。

三、放射免疫分析的質(zhì)量控制

（一)質(zhì)量控制的目的和內(nèi)容

放射免疫分析的質(zhì)量控制實(shí)際上就是控制測定誤差，監(jiān)督測定結(jié)果。它包括兩方面的內(nèi)容：一方面對測定結(jié)果做精確分析；另一方面鑒定常規(guī)測定方法，對那些測定結(jié)果不好的方法加以改進(jìn)，并建立新的測定方法。質(zhì)量控制分四個(gè)方面：

1．在一個(gè)測定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。

2．在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤差。

這兩種情況屬于內(nèi)部質(zhì)量控制。

3．用同一測定方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。

4．采用不同方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。

后兩種情況屬于外部質(zhì)量控制。

（二)放射免疫分析中造成測量誤差的因素

誤差包括系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差發(fā)生在測量過程中由于儀器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定等原因，使測定結(jié)果呈傾向性偏大或偏小，這種誤差應(yīng)力求避免。隨機(jī)誤差是測量過程中各種偶然因素造成的，沒有固定的傾向性，這類誤差是不可避免的，必要時(shí)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

造成誤差的可能來源有以下幾個(gè)方面：

1．各種儀器：設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、效率以及被污染等情況帶來的誤差。如：①由于放射性測量儀器的穩(wěn)定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測物的放射性強(qiáng)度等原因。②由于樣品的自吸收，本底校正，測定時(shí)間，可能的污染等原因。③在試驗(yàn)室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準(zhǔn)和使用方法等原因。④由于反應(yīng)試管、移液管以及測定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對測定結(jié)果帶來誤差。

2．試劑的純度、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標(biāo)記抗原的比度、純度，輻射自分解，抗體的穩(wěn)定性，分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。

3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當(dāng)?shù)仍斐傻恼`差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來誤差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規(guī)程操作等也都可以造成誤差。

4．樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件，微量樣品取樣的準(zhǔn)確度，樣品可能造成的污染以及樣品的變性（如免疫反應(yīng)活性的降低、蛋白質(zhì)的變性等)也都能造成測量的誤差。

5．提取及層析分離過程中的丟失。

（三)放射免疫分析中測量誤差的控制

1．選擇準(zhǔn)確性高的方法：對各種方法進(jìn)行比較，淘汰粗糙及難以重復(fù)的方法。

2．建立方法對比。用相同的測量方法和不同的測量方法在同一實(shí)驗(yàn)室和不同實(shí)驗(yàn)室，在同一地區(qū)和不同地區(qū)，在同一時(shí)間和不同時(shí)間，對同一樣品進(jìn)行對比，檢查產(chǎn)生誤差的原因。

3．建立各種類型的標(biāo)準(zhǔn)。對標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)規(guī)定純度及制備方法，使用年限及貯存條件。

4．建立操作規(guī)程，按章　操作。對使用的試劑、儀器設(shè)備要經(jīng)常檢查其有效性，更換試劑時(shí)應(yīng)進(jìn)行必要的鑒定，必要時(shí)對測定方法要做重復(fù)性試驗(yàn)和回收試驗(yàn)。

5．建立可靠的檢查制度。經(jīng)常對測定結(jié)果進(jìn)行核查，利用控制血清、標(biāo)準(zhǔn)血清檢查每批結(jié)果的準(zhǔn)確性。