膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的原理，一般認(rèn)為是由于pH值等于或稍偏堿于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性，此時(shí)蛋白質(zhì)分子與膠體金顆粒相互間的靜電作用較小，但蛋白質(zhì)分子的表面張力卻最大，處于一種微弱的水化狀態(tài)，較易吸附于金顆粒的表面，由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金顆粒的表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)，如果＝低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，膠體金帶負(fù)電荷，二者極易靜電結(jié)合形成大的聚合物。如果pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，與金顆粒的負(fù)電荷相互排斥而不能互相結(jié)合。為防止蛋白質(zhì)與膠體金的聚合與沉淀，常用牛血清白蛋白，卵白蛋白，聚乙二醇或明膠作穩(wěn)定劑。用Sephacryb S—400 （丙烯葡聚糖S—400)層析分離純化膠體金蛋白標(biāo)記物只適用于以BSA作穩(wěn)定劑者。
（1)透析除鹽：蛋白質(zhì)溶液內(nèi)應(yīng)除去多余的電解質(zhì)，不然過(guò)高的鹽類物質(zhì)會(huì)降低膠體金顆粒的Zeta電位，影響蛋白質(zhì)的吸附，因此，標(biāo)記之前必須徹底除鹽。一般將蛋白質(zhì)置入透析袋中然后直接放入雙蒸水或極低濃度的m.bhskgw.cn/rencai/鹽水（0.005mol/l NaCl , pH7.0)透析。
（2)去除蛋白質(zhì)中的沉淀：長(zhǎng)期低溫保存的蛋白質(zhì)或4℃較長(zhǎng)時(shí)間保存的抗體，特別是在濃度高于2mg/ml的情況下，很容易形成聚合物，聚合物對(duì)標(biāo)記過(guò)程及免疫金探針的穩(wěn)定性有一定影響，因此，標(biāo)記之前須離心以除去這些聚合物。一般以100000r/min 4℃離心60min取上清液，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至1mg./ml即可用于標(biāo)記。
膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)（PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。需要提高膠體金的pH值時(shí)可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時(shí)可用0.1n HCl。測(cè)定金溶液的pH可能損害pH測(cè)定計(jì)的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測(cè)定其pH即可。
幾種常用的蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值見(jiàn)表5-4。
表5-4 常用幾種蛋白質(zhì)標(biāo)記時(shí)膠體金所用的pH值如下
| 蛋白質(zhì) | pH |
| 抗體（γ球蛋白) | 9.0 |
| 親合層析的IgG | 7.6 |
| 單克隆抗體 | 8.2 |
| F（ab＇)2 | 7.2 |
| SPA(葡萄球菌蛋白) | 6.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅰ | 8.0 |
| 蓖麻子植物凝血素Ⅱ | 8.0 |
| 花生凝集素 | 6.3 |
| Helix pomatia lectin | 7.4 |
| 大豆凝集素 | 6.1 |
| Lens Culinaris lectin | 6.9 |
| Lotus Tetragonolobus lectin | 6.3 |
| 荊豆凝集素 | 6.3 |
| Bandeirae simplicifolia lectin | 6.2 |
| 過(guò)氧化物酶 | 8.0 |
| 類卵粘蛋白 | 4.8 |
| 血漿銅蘭蛋白 | 7.0 |
| α-胎球蛋白 | 6.5 |
| 小牛血清白蛋白 | 6.5 |
| 牛血清白蛋白 | 5.5 |
| 牛血球白蛋白結(jié)合肽 | 4.5 |
| 牛血清白蛋白結(jié)合胰島素 | 5.3 |
| 霍亂毒素 | 6.9 |
| 破傷風(fēng)毒素 | 6.9 |
| DNAase | 6.0 |
| RNAase | 9.0 |
| 低密度脂蛋白 | 5.5 |
| α2-巨球蛋白 | 6.0 |
| 抗生物素蛋白（親合素) | 10.0 |
| 鏈霉抗生物素蛋白 | 6.6 |
| 麥胚凝集素 | 9.9 |
（1)光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質(zhì)溶液（1ml)，分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測(cè)各管。根據(jù)膠體金顆粒的大小，OD在520～580nm之間測(cè)定，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)用量為橫坐標(biāo)作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn)處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最www.med126.com適穩(wěn)定量為45μg/ml。
.jpg)
圖5-2 蛋白最適穩(wěn)定量示意圖
（2)目測(cè)法：以目測(cè)法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級(jí)稀釋后（由5μg～45μg另設(shè)對(duì)照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表5-5順序進(jìn)行。
表5-5 具體的做法是按表內(nèi)進(jìn)行
| 管數(shù) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 膠體金（ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 蛋白質(zhì)（μg) | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 0 |
| 10%NaCl(ml) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
①當(dāng)分別加入0.1ml 10%氯化鈉后、混勻靜置2h以上觀察結(jié)果。
②沒(méi)有加入蛋白質(zhì)的管為對(duì)照管。
③小于5nm顆粒的膠體金溶液，每個(gè)管內(nèi)應(yīng)加入5μl33%的雙氧水，否則有不變藍(lán)色及聚沉現(xiàn)象。未加蛋白及加入蛋白量不足以穩(wěn)定膠體金的試管，即呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而加入蛋白量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的試管則膠體金的紅顏色不變。其中含蛋白量最低的試管即含穩(wěn)定1ml膠體金的必須蛋白量。在此基礎(chǔ)上再加上20%即為穩(wěn)定所需蛋白質(zhì)的實(shí)際用量。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：
（1)根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記蛋白質(zhì)的總量。
（2)在電磁攪拌下，將蛋白質(zhì)溶液加入膠體金溶液中（pH已調(diào)至PI超過(guò)0.5pH)，加入蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)逐滴加入，1mg的蛋白質(zhì)大約5min加完。
（3)在磁性攪拌下加入5%的牛血清白蛋白（BSA)使其終濃度為1%，或加入3%聚乙二醇（PEg MW20000)使其終濃度為0.05%, 我們對(duì)比了BSA和PEG穩(wěn)定膠體金的效果，BSA穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金，放在4℃達(dá)2年半仍然保持良好性能，而用PEG穩(wěn)定的標(biāo)記膠體金放在4℃1年左右就有分層現(xiàn)象，而且染色效果顯著下降。因此，我們認(rèn)為最好還是用BSA作穩(wěn)定劑。
（4)將標(biāo)記好的膠體金裝入透析袋中，兩頭扎緊，放入蔗糖或硅膠中濃縮，濃縮到原體積的1/10量，濃縮完畢后純化。離心法純化時(shí)，不要濃縮。
標(biāo)記好的免疫金探針必須經(jīng)過(guò)純化處理以后才能用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。純化的目的是除去其中未標(biāo)記的蛋白質(zhì)，未充分標(biāo)記的膠體金以及在標(biāo)記過(guò)程中可能形成的各種聚合物。
（1)將標(biāo)記的大于10nm的膠體金溶液選用15000r/min 4℃離心15min，吸出上清，棄去沉淀，以去除大的聚合物。
（2)一般在10nm以上所標(biāo)記的膠體金均可在調(diào)整離心機(jī)上離心，小于10nm顆粒的膠體金用超速離心機(jī)離心，在4℃離心1h左右，棄上清，將沉淀以原體積的0.02mol./l TBSpH8.2（內(nèi)含1%BSA，0.05%疊氮鈉)溶解，重復(fù)離心2～3次，沉淀溶于原體積的1/10TBS中。4℃保存?zhèn)溆�。為了得到顆粒均勻一致的免疫金試劑，上述粗提制劑可用10%～30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度離心，分帶收集不同大小顆粒的膠體金標(biāo)記蛋白制劑。
幾種免疫金探針離心所用轉(zhuǎn)速（見(jiàn)表5-6)，離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速見(jiàn)表5-7，膠體金的OD值見(jiàn)表5-8。
表5-6 幾種免疫金探針離心時(shí)所用轉(zhuǎn)速參考表
| 膠體金顆粒直徑（nm) | 蛋白質(zhì) | 時(shí)間（min) | 轉(zhuǎn)速（r) |
| 3.0 | GAR IgG | 60 | 30000 |
| 5.0 | GAR IgG | 50 | 25000 |
| 10.0 | RAM IgG | 50 | 19000 |
| 15.0 | SPA | 40 | 17000 |
| 15.0 | ALcc IgG | 40 | 17000 |
| 20.0 | SPA | 40 | 13000 |
| 25.0 | SPA | 35 | 12000 |
說(shuō)明：GAR IgG=羊抗兔IgG；RAm IgG=兔抗鼠IgG；ALcc IgG=抗肝細(xì)胞癌IgG; SPA=葡萄球菌A蛋白
表5-7 幾種免疫金探針離心純化時(shí)所用轉(zhuǎn)速
| 膠體金顆粒（nm) | pH | 蛋白質(zhì) | 轉(zhuǎn)速（xg) | 時(shí)間（min) |
| 5 | 9.0 | 羊抗人IgG | 45000 | 45 |
| 10 | 8.2 | 抗胃癌單克隆抗體 | 45000 | 30 |
| 15 | 6.5 | 鏈霉親和素 | 12000 | 45 |
| 20 | 6.0 | SPA | 12000 | 30 |
將純化好的膠體金用0.02mol/l TBS緩沖液作1：20稀釋，用520nm測(cè)OD值。
表5-8 不同大小膠體金的OD值
| 膠體金顆粒大�。╪m) | OD（520)nm |
| 5 | 2.5 |
| 10 | 2.5 |
| 15 | 3.5 |
| 20 | 5.0 |
為純化免疫金探針的最好方法，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)便，過(guò)濾的膠體金顆粒比較均勻，不容易凝集，而離心方法轉(zhuǎn)速高，時(shí)間長(zhǎng)，膠體金顆粒沉淀容易凝集，用凝膠過(guò)濾克服了這一弱點(diǎn)。選用本方法時(shí)膠體金溶液必須用牛血清白蛋白作穩(wěn)定劑。具體操作過(guò)程如下：
（1)將濃縮好的膠體金以1500r/min離心去掉大的聚合物。吸出上清待過(guò)柱。
（2)柱高34cm,直徑1cm,加樣體積為柱床體積的1/10。
（3)丙烯葡聚糖S-400（Sephacryls—400, Pharmacia, Sweden)裝柱后用0.02mol/lpH8.2TBS平衡層析柱（pH7.4者用于標(biāo)記的SPA)，平衡好后，吸取上清膠體金液體加入層析柱內(nèi)，加樣時(shí)請(qǐng)注意不要破壞S—400的界面。
（4)用0.02mol/lpH8.2 TBS洗脫，先行濾出的液體有少量微黃不透亮的液體，緊接著是濃度高紅色而透亮的膠體金，注意顏色的變化，如紅色變淡，變黃立刻停止收集。如Sephacryls—400沒(méi)有，也可以用Sepharose –4B或6B代替（Pharmacia,Sweden)也能收到較好的效果。
（1)用有Formvar 膜的鎳網(wǎng)沾取金標(biāo)蛋白溶液，空氣中干燥后醋酸鈾復(fù)染，在TEM下觀察，可見(jiàn)金顆粒周圍有一明顯的空暈，表示顆粒表面吸附有蛋白質(zhì)分子。
（2)純化后免疫金探針是否保持很好的生物學(xué)活性是判斷其質(zhì)量好壞的主要指標(biāo)，因此，在使用之前必須對(duì)它的特異性，敏感性進(jìn)行鑒定。鑒定舉例，用陽(yáng)性抗原片，脫蠟至水，胰蛋白酶消化，加第一抗體（多克隆或單克隆)，一般過(guò)夜再加標(biāo)記抗同一抗特異性抗體結(jié)合的膠體金溶液（多克隆或單克隆抗體標(biāo)記的膠體金)詳細(xì)方法步驟見(jiàn)后IgGS法，一般做1：2，1：4，1：8，1：16，稀釋SPA-金，做1：10，1：20，1：40，1：80稀釋，37℃45min，沖洗，顯色，觀察結(jié)果，染色效價(jià)以陽(yáng)性結(jié)果明確，背景淺的稀釋度為標(biāo)準(zhǔn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色試驗(yàn)可以較全面地反應(yīng)免疫金探針的質(zhì)量。
