本品系用傷寒、副傷寒甲、乙菌分別培育，取菌苔制成懸液經(jīng)甲醛殺菌，以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成每ml含傷寒菌1.5億、副傷寒甲、乙菌各0.75億制成。用于預(yù)防傷寒及副傷寒甲、乙。
1 菌種
1.1菌種來(lái)源
制造傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗用的菌種及檢定菌種用的各種診斷血清，應(yīng)由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。
1.2 菌種檢定
檢定菌種可用pH7.2～7.4的肉湯瓊脂、馬丁瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。
1.2.1 培養(yǎng)特性
各菌株應(yīng)具有典型的形態(tài)、培養(yǎng)及生化特性。
1.2.2 血清凝集試驗(yàn)
用37℃培育18～20小時(shí)的培養(yǎng)物以磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋成含菌6億/ml，與相應(yīng)的傷寒、副傷寒甲、乙菌診斷血清做定量凝集試驗(yàn)，搖勻后放37℃過(guò)夜，以肉眼可見(jiàn)到凝集（+)之血清最高稀釋度為凝集反應(yīng)之效價(jià)，凝集價(jià)不應(yīng)低于血清原效價(jià)之半。傷寒菌種加用傷寒Vi及O血清做凝集試驗(yàn)，應(yīng)與Vi血清有凝集，與O血清不凝集，或僅有較低凝集。
1.2.3 毒力試驗(yàn)
用37℃培育12～16小時(shí)的瓊脂培養(yǎng)物以生理鹽水稀釋為下列濃度的菌液：
傷寒、副傷寒乙菌種：3億/ml、1.5億/ml及0.75/ml。
副傷寒甲菌種；15億/ml、7.5億/ml及3.75億/ml。
根據(jù)菌種毒力情況稀釋度可作更改，也可增加稀釋度。
每一稀釋度的菌懸液腹腔注射體重14～16g之小白鼠，至少5只，每只0.5ml，觀察3天，使小白鼠于感染后3天內(nèi)全部死亡的最小劑量為1個(gè)致死量（LD)，傷寒、副傷寒乙菌種1LD應(yīng)不超過(guò)1.5億菌，副傷寒甲不超過(guò)7.5億菌。
1.2.4 毒性試驗(yàn)
用37℃培育18～20小時(shí)之瓊脂培養(yǎng)物混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水內(nèi)，傷寒及副傷寒甲菌液加溫56℃1小時(shí)，副傷寒乙菌液加溫58℃1小時(shí)殺菌（或其他方法殺菌)，不加防腐劑。殺菌試驗(yàn)合格后稀釋為每ml含菌60、30及15億等3個(gè)濃度，每一濃度的菌懸液以0.5ml腹腔注射體重15～18g小白鼠5只，觀察3天，注射7.5億菌之小白鼠應(yīng)全部生存，注射15億菌之5只小白鼠可有3只死亡。
1.2.5 免疫力試驗(yàn)
用加溫殺菌（或用其他方法殺菌)不加防腐劑的菌液稀釋成如下的濃度：
傷寒及副傷寒乙菌液：2.5億/ml。
副傷寒甲菌液：5億/ml。
每一菌液免疫體重14～16g小白鼠至少30只，每只皮下注射上述濃度的菌液0.5ml。注射2次，間隔7天，末次免疫后9～11天進(jìn)行毒菌攻擊。每種死菌菌液免疫之小白鼠各腹腔注射1LD的相應(yīng)毒菌（www.med126.com含于0.5ml中)，同時(shí)應(yīng)用同批飼養(yǎng)或體重與免疫組相同的小白鼠3組，每組至少5只作對(duì)照，分別于腹腔注射2、1及1/2LD的毒菌（各含于0.5ml中)，觀察3天。對(duì)照組小白鼠感染2及1LD者應(yīng)全部死亡，感染1/2LD者要有部分死亡。傷寒、副傷寒乙菌液免疫組至少保護(hù)70%小白鼠活存，副傷寒甲菌液免疫組至少保護(hù)60%小白鼠活存，則免疫力試驗(yàn)為合格。
免疫力試驗(yàn)也可用LD50法判定結(jié)果：
用加溫殺菌（或用其他方法殺菌)不加防腐劑的菌液稀釋成如下的濃度：
傷寒及副傷寒乙菌液：2.5億/ml。
副傷寒甲菌液：5億/ml。
每一菌液免疫體重14～16g之小白鼠至少30只，每只皮下注射上述濃度的菌液0.5ml，注射2次，間隔7天，末次免疫后9～11天，用培養(yǎng)12～16小時(shí)的傷寒、副傷寒甲或乙菌株之菌苔以pH7.2～7.4的肉湯及生理鹽水等稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛冗M(jìn)行攻擊。免疫組小白鼠應(yīng)感染100個(gè)LD50以上的毒菌。同時(shí)應(yīng)用同批飼養(yǎng)或體重與免疫組相同的小白鼠分為3～4組，每組至少5只，分別感染不同劑量毒菌作對(duì)照。免疫組及地照組分別腹腔注射0.5ml，觀察3天，計(jì)算LD50。免疫組至少應(yīng)保護(hù)70%小白鼠存活。
在做免疫力試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)以參考菌苗作對(duì)照。
1.2.6 抗原性試驗(yàn)
選體重2kg左右之健康家兔至少3只，用免疫力試驗(yàn)所用之菌液靜脈注射3次每次0.5ml，第1次注射7億菌，第2次14億菌，第3次21億菌，每次間隔7天。末次注射后10～14天采血做定量凝集試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)。傷寒菌免疫的血清對(duì)免疫菌效價(jià)應(yīng)不低于1∶12800，副傷寒甲、乙效價(jià)不低于1∶6400，2/3家兔血清之凝集價(jià)達(dá)上述要求即為合格。
1.3 菌種保存
菌種應(yīng)凍干保存，凍干菌種保存于2～8℃。
菌種凍干后應(yīng)抽取樣品按1.2項(xiàng)進(jìn)行檢查，合格后可使用3年。以后每次生產(chǎn)前必須檢查全部特性一次，合格者可繼續(xù)使用2年。
2 菌苗制造
制造傷寒、副傷寒甲、乙三聯(lián)菌苗所用的每一菌種選用2個(gè)菌株。
2.1 菌種
凍干菌種啟開(kāi)后應(yīng)檢查菌形、純度及進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)（傷寒菌加用Vi血清)，合格后即可使用。每啟開(kāi)1支凍干菌種用于生產(chǎn)不應(yīng)超過(guò)6代。
2.2 制造用培養(yǎng)基
用pH7.2～7.4的馬丁瓊脂或肉湯瓊脂或其他適宜的培養(yǎng)基。
2.3 原液制造
2.3.1 接種
采用涂種，接種后置37℃培育18～14小時(shí)。
2.3.2 采集
采集前逐瓶檢查，有雜菌者廢棄。刮取菌苔混懸于磷酸鹽緩沖生理鹽水中。
2.3.3 純菌試驗(yàn)
原液采集后應(yīng)逐瓶取樣接種瓊脂斜面1管，于37℃培育3天，24～26℃1天，有雜菌生長(zhǎng)應(yīng)廢棄。
2.3.4 殺菌
原液用甲醛溶液殺菌，各種原液加入甲醛溶液濃度如下：
傷寒菌原液不超過(guò)1.1%±0.1%（ml /ml)。
副傷寒甲菌原液不超過(guò)1.4%m.bhskgw.cn/yishi/±0.1%（ml /ml)。
副傷寒乙菌原液不超過(guò)1.8%±0.2%（ml /ml)。
加殺菌劑后的原液應(yīng)放在37℃，不得超過(guò)7天，以后保存于2～8℃。
2.3.5無(wú)菌試驗(yàn)
純菌試驗(yàn)合格的原液，應(yīng)取樣接種不含瓊脂的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基及普通瓊脂斜面各1管，放37℃培育5天有本菌生長(zhǎng)，可加倍量復(fù)試一次；有雜菌生長(zhǎng)應(yīng)廢棄。
2.3.6 原液合并
無(wú)菌試驗(yàn)合格之原液，按不同菌株或不同制造日期分別過(guò)濾合并，合并后應(yīng)加不超過(guò)0.5%（g /ml)的苯酚或其他適宜之防腐劑，保存于2～8℃。
2.4 原液檢定
2.4.1 鏡檢
菌形應(yīng)正常，無(wú)雜菌。
2.4.2 凝集試驗(yàn)
原液與相應(yīng)血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，其凝集效價(jià)不應(yīng)低于血清原效價(jià)之半。
2.4.3無(wú)菌試驗(yàn)
按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
2.4.4 濃度測(cè)定
應(yīng)按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量檢定部門會(huì)同測(cè)定濃度。
2.4.5 免疫力試驗(yàn)
原液于無(wú)菌試驗(yàn)合格后與質(zhì)量檢定部門會(huì)同進(jìn)行。抽驗(yàn)批數(shù)應(yīng)不少于生產(chǎn)批數(shù)的1/5。方法同1.2.5項(xiàng)，唯所用小白鼠每組至少15只。對(duì)傷寒或副傷寒甲乙毒菌之攻擊，均應(yīng)保護(hù)60%小白鼠活存為合格。
2.5 原液保存
原液應(yīng)保存于2～8℃。原液自采集之日起至用于菌苗稀釋時(shí)不得少于4個(gè)月，保存效期自采集之日起為2年半。
2.6 菌苗稀釋
2.6.1 原液配合
稀釋前應(yīng)先將不同菌種所制之原液按比例配合。每一種菌所加的菌數(shù)與應(yīng)加菌數(shù)在總菌數(shù)不變的原則下，允許兩種菌之間在20%的范圍內(nèi)互有增減；同一種菌不同菌株之原液按等量混合，但每個(gè)菌株所加的菌數(shù)與應(yīng)加菌數(shù)在總菌數(shù)不變的原則下，允許兩個(gè)菌株之間在40%范圍內(nèi)互有增減。
2.6.2 菌苗稀釋
稀釋菌苗用含0.25%～0.5%（g /ml)苯酚或其他適宜的防腐劑之磷酸鹽緩沖生理鹽水。
2.6.3 苗菌濃度
菌苗每ml含傷寒菌1.5億，副傷寒甲及副傷寒乙菌各0.75億。
2.7 菌苗分批
同組配合的原液用同批稀釋液在同一日稀釋的種瓶菌苗為1批。大罐稀釋時(shí)應(yīng)按大罐分批，并按分裝機(jī)分為亞批。
2.8 檢定
稀釋后每批應(yīng)逐瓶抽樣進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)及測(cè)定防腐劑含量（大罐稀釋時(shí)除外)。
2.9 分裝
分裝后應(yīng)每亞批抽樣送質(zhì)量檢定部門進(jìn)行成品檢定。
3 成品檢定
3.1物理化學(xué)檢查
菌苗應(yīng)為乳白色懸液，pH值為6.8～7.4，不應(yīng)有搖不散的菌塊或異物。苯酚含量應(yīng)為0.25%～0.5%（g /ml)。
3.2 菌形及純度
染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陰性桿菌。至少觀察10個(gè)視野，平均每個(gè)視野內(nèi)不得有10個(gè)以上非典型菌（線狀、粗大或染色可疑桿菌)，并不應(yīng)有雜菌。
3.3 無(wú)菌試驗(yàn)
按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
3.4 安全試驗(yàn)
3.4.1 毒性試驗(yàn)
用體重18～20g之健康小白鼠5只，每只腹腔注射菌苗0.5ml，或用體重350～450g之健康豚鼠2只，腹腔注射菌苗1.5ml，觀察7日，應(yīng)無(wú)死亡。
3.4.2 防腐劑試驗(yàn)
用體重18～20g之健康小白鼠2只，每只皮下注射菌苗0.5ml，用苯酚作防腐劑的菌苗注射的小白鼠可發(fā)生戰(zhàn)栗癥狀，但不應(yīng)超過(guò)半小時(shí)，觀察7日不得有局部膿腫或死亡。
4 保存與效期
應(yīng)保存于2～8℃。自稀釋之日起效期為1年半。如原液保存超過(guò)1年稀釋，應(yīng)相應(yīng)縮短效期（自原液采集之日起總效期不得超過(guò)2年半)。
