慢性胃。˙型胃炎、胃潰瘍等)及十二指腸球部潰瘍等一類常見病、多發(fā)病,長期以來,其病因尚未闡明。1983年澳大利亞學(xué)者Warren和Marshall從慢性活動性胃炎病人胃粘膜活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)并分離出幽門螺桿菌(Helicobacter pylori Hp)后,引起了全世界消化病學(xué)與有關(guān)基礎(chǔ)科學(xué)的普遍關(guān)注。幾年來,各國對Hp的研究迅猛發(fā)展,其中主要為臨床實用性研究,有關(guān)Hp生物學(xué)特征相對較少,至于Hp具體致病機理則更少。
我們是從1985年開始與上海市消化疾病研究所合作開展這方面研究工作的,我們開初的工作(1985~1986)主要有:①在國內(nèi)最早分離培養(yǎng)成功了Hp;②對上海地區(qū)各種慢性胃病中的Hp檢出率作了調(diào)查;③用雙盲法探討痢特靈、滅滴靈治療Hp陽性慢性胃炎的療效,并驗證Hp感染與慢性胃病人發(fā)病關(guān)系。上述研究結(jié)果表明:①我國Hp感染率與各種慢性胃病的關(guān)系和文獻報道的同樣廣泛和密切;②根據(jù)Hp的檢出率與各種慢性胃病的高度相關(guān)性、Hp感染者經(jīng)適當(dāng)藥物治療后與臨床癥狀緩解,以及病理表現(xiàn)改善的密切程度,支持慢性胃病的Hp感染學(xué)說。1988年,我們又用Hp超聲粉碎的抗原以ELISA法測定了Hp感染的慢性胃炎及消化性潰瘍病人、健康體檢者和新生兒血清中的抗Hp-IgG抗體,結(jié)果表明:①B型胃炎及消化性潰瘍病人的陽性率明顯高于A型胃炎及健康體檢組;②體檢組中抗Hp-IgG陽性率隨著年齡組的增長而升高,30歲~50歲組達(dá)最高峰,70歲以上又稍有下降,③新生兒組抗Hp-IgG陽性率反比1/2歲~10歲年齡組為高,接近成人水平。其抗體可能通過胎盤來自母體中,提示Hp是后天獲得感染。上述人群中,抗Hp-IgG抗體水平調(diào)查的結(jié)果又增強了慢性胃病的Hp感染之說。
1987年我們微生物學(xué)教研室以“彎曲菌樣細(xì)菌(Campylobacter-like organisms,CLOS)的生物學(xué)地位及致病物質(zhì)的研究”課題名稱申請得到國家自然科學(xué)基金的資助。由此對Hp的生物學(xué)性狀作了比較全面系統(tǒng)的研究,企圖對Hp的生物學(xué)地位及致病機理作一些探討。
1 材料和方法
1.1 材料
、贅(biāo)本1985年5月~1989年10月分別取自上海市仁濟醫(yī)院、紡二醫(yī)院、新華醫(yī)院有上消化道主述病人的內(nèi)窺鏡檢查標(biāo)本。②菌種Hp均分自病人。除藥敏試驗和與空腸彎曲菌的交叉反應(yīng)者外,都以88065,88073,88082,88109,88152五個菌株作為代表進行試驗研究。
參考菌種:空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni,CJ)CJ-3276株和結(jié)腸彎曲菌F(Campylobacter coli,CC)CC-3278株由法國Borbeaux兒童醫(yī)院Megraud 博士惠贈,空腸彎曲菌CJ-S131由蘇州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。胎兒彎曲菌(Campylobacter fetus,CF)日本大阪大學(xué)微生物學(xué)研究所三輪谷俊夫教授惠贈。
1.2 方法
1.2.1 光學(xué)顯微鏡檢查 取胃粘膜活檢標(biāo)本或菌種培養(yǎng)物在潔凈玻片上涂薄膜。自然干燥,加熱固定,革蘭染色后油鏡檢查。另取胃粘膜活檢標(biāo)本作石蠟包埋切片,四苯胺蘭(touidine blue)染色鏡檢。
1.2.2 分離培養(yǎng) 空腸彎曲菌選擇性基礎(chǔ)瓊脂(上海市衛(wèi)生防疫站生產(chǎn))中補充以10%羊血和1%可溶性淀粉,并每1000ml培養(yǎng)基中加入1ml萬古霉素(10mg/ml),1mlTMP(5 mg/ml)和1mloctidione(5 mg/ml)制成平板后,置Queue三氣培養(yǎng)箱(美國產(chǎn)),氣體調(diào)節(jié)至5%O2,85%N2和10%CO2,37°C培養(yǎng)3d后觀察。
1.2.3 生化鑒定 主要參考 Cliodna等方法:①氧化酶反應(yīng) 用竹簽挑取血平板上可疑菌落至已被1%鹽酸二甲基對苯二胺(E.Mer-ck,Darmstadt產(chǎn)品)溶液浸透、并預(yù)先干燥過的濾紙上,10s內(nèi)出現(xiàn)深紫紅色為陽性。②觸酶反應(yīng) 用含3%H2O2液的毛細(xì)玻管碰觸血平板上菌落,有氣泡升起為陽性。③尿素酶反應(yīng) 將含有菌落棉拭插入尿素肉湯中,30s內(nèi)棉拭呈粉紅色為陽性。④DNA酶試驗 在含有甲葳胺蘭核酸瓊脂的平皿上打孔后,將細(xì)菌懸液加于孔中,37°C培養(yǎng)2h后觀察結(jié)果。小孔周圍出現(xiàn)透明小圈者為陽性。⑤堿性磷酸酶反應(yīng) 用0.02mol/LpH8.0Tris-HCL洗下細(xì)菌菌落。加入0.5ml1%磷酸對硝基苯脂(Beckman產(chǎn)品),37°C水浴1 h ,觀察結(jié)果。呈黃色者為陽性。⑥亮氨酰胺肽酶反應(yīng) 取小試管2只,1只測定管加待測菌液(約3×1010cfu/ml)0.05ml,另1只空白對照管加H2O0.05ml。然后各加0.2M磷酸緩沖液(pH7.2)0.45ml和基質(zhì)液(亮氨酰-β-萘胺鹽酸20mg溶于H2O25ml,加入0.2mol/LpH7.2的磷酸緩沖液25ml,充分混勻)0.5ml。37°C水浴30min后各加入40%三氯醋酸0.2ml。充分混勻后4000r/min離心沉淀10min。從測定管和空白對照管中各取上清液0.5ml分別裝入另2只試管中,并分別加2NHCI0.5ml和0.2%NaNO20.5ml。充分混勻,室溫(20°C)中靜置10min。再各加0.5%氨基磺酸胺10ml;靹蚝螅覝兀20°C)靜置10min 。最后各加N-萘乙烯二胺二鹽酸鹽溶液[稱取N-(1-萘)乙烯二胺二鹽酸(分析純,瑞士,Lichtemptindicht生產(chǎn))100mg,溶于95%乙醇200ml中,冰箱保存可穩(wěn)定1個月。臨用時,以95%乙醇稀釋10位后使用] 2.0ml。20min后觀察結(jié)果。呈紫色為陽性。⑦馬尿酸鹽水解試驗 接種1環(huán)48hCJ/CC培養(yǎng)物或72hHp培養(yǎng)物于0.4ml含1%馬 尿酸鹽水溶液的小試管中,混勻,放置37°C水浴2h,再輕輕倒入0.2ml茚三酮試劑(3.5g茚三酮溶于100ml丙酮:丁醇=1:溶液)于各管。置37°C水浴,經(jīng) 10min后看結(jié)果。深紫色為陽性反應(yīng)。
1.2.4 抗菌藥物敏感性試驗 用瓊脂稀釋法測定13種抗菌物(青霉素G、鏈霉素、慶大霉素、紅霉素、先鋒霉素V、四環(huán)素、痢特靈、滅滴靈、TMP、潔霉素、次硝酸鉍、多粘菌素B、萬古霉素)對30個(Hp)菌株(Hp菌株號:85025,85084,85114,85117,85120,85143,85187,85485,85507,85508,85524,85553,85558,85560,85562,85568,85596,85595,85621,85623,85625,85629,85634,85639,85643,85647,85648,85660,85663,85677)的最小抑菌濃度(Minimal inhibition Concentration,MIC)。①菌液準(zhǔn)備:待測菌株落分別用生理鹽水洗下,比濁調(diào)整至108fu/ml。②藥敏平板制備:分別取200ul不同種類、不同濃度的抗菌藥物稀釋(抗菌藥物的濃度為0.05μg~100μg/ml的對倍稀釋液的對倍稀釋系列)置于空的無菌平皿(φ9 cm)中。每只平皿加入加熱融化的血瓊脂10ml,輕輕搖動使培養(yǎng)基與抗菌藥物均勻混合。待瓊脂凝固后備用。③細(xì)菌拉種:用多點接種器(M2T-P)將菌液點種于上述每只藥皿平板上。每個平板點種25個菌種。置微需氧環(huán)境中培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果。如Hp在某個抗菌藥物濃度的培養(yǎng)基上生長,而在前一個大一倍的嘗試的培養(yǎng)基上不長,則以此前一個平板中的抗菌藥物嘗試為該菌的MIC。
1.2.5 菌種保存 挑取3~5環(huán)分純的Hp菌種(菌號:88064,88065,88073,88075,88077,88082,88099,88108,88109,88152,88223,85289,85682,85688)于裝有滅菌脫脂牛奶的Eppendorf塑料離心管,置-70°C凍存。經(jīng)1年后復(fù)蘇鑒定。
1.3 超微結(jié)構(gòu)的研究
以Hp88065,88073,88082,88109,88152菌株及CJ-3276,CJ-131、CC3278參考菌株制成負(fù)染和超薄切片,置H-500透射電鏡下觀察。取新鮮采集的胃粘膜活檢標(biāo)本經(jīng)固定后在臨界點下干燥,真空涂金。在JEOL JSM0S40掃描電鏡下觀察。
1.4 Hp的DNA G+Cmol%與菌體脂肪酸組成測定
1.4.1 細(xì)菌DNA中G+Cmol%含量的測定 主要參贊丁鑒等高壓液相色譜測定。①Hp DNA的提;將細(xì)菌懸液經(jīng)4000e/min×15離心沉淀,用0.15mol/LnaCI-0.1M EDTA pH8.0 溶液(SE液)洗一次后,重懸浮于10mlSE液中。加溶菌酶,使終濃度為2%的SDS,放60°C水浴15min。用等體積酚/氯仿·異戊醇(體積之比為3/1)抽提二次后,再用等體積氯仿/異戊醇(體積之比為24/1)和等體積乙醚各抽提一次。水相在pH7.8,10mmol/L Tris-HCI,1mmol/L ED-TA中透析4°C過夜。透析后的抽提液中加入經(jīng)100°C、15min處理的Rnase,使終嘗試為200ug/ml,37°C,2h。加蛋白酶K,終嘗試為200ug/ml,37°C輕搖2h。用等體積酚/氯仿(體積之比為1/1)和等體積氯仿·異戊醇各抽提一次。水相加NaCl和0.1M,溶解后,加入2倍體積的冷無水乙醇;靹蚝,①-20°C,13000g×30min,得DNA沉淀。②游離堿基的制備:在DNA沉淀物中加入100μl72%高氯酸,使完全溶解后,移入安瓿中,熔封管口。100°C水解1h,放入4°C冰箱待用。③高壓液相色譜測定:用Shimadzu LC-4A高壓液相色譜義;柱為不銹鋼制,4.6mm×250mm;填充材料為Nucleosil C18,5um。流動相為0.1mol/L pH3.9甲酸鈉,流速0.8ml/min。壓力120kg/cm2,柱溫40°C檢測器為UV254nm,0.02AuFs。④標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:用電子稱(Sartorius research)分別準(zhǔn)確稱取腺嘌呤(A,,英國BDH產(chǎn)品),嘌呤(G,Sigma產(chǎn)品),胞嘧啶(C,中科院生化所產(chǎn)品)和胸腺嘧啶(T,上海市化學(xué)試劑公司產(chǎn)品)。加數(shù)滴磷酸,以高壓液相色譜儀標(biāo)定出峰位置。⑤堿基物相對克分子樣正因子的測定和G+Cmcl1%的計算:
表1 四種堿基的分子量、毫克/分子濃度及相對克分子較正因子
堿基 |
Mr |
混標(biāo)中的量(mg) |
混標(biāo)中的mg分子濃度 |
進樣量×10-3mmol/L |
F-m(i) |
A |
135.14 |
4.17 |
0.616 |
6.17 |
1.00 |
G |
151.10 |
4.60 |
0.609 |
6.09 |
0.95 |
T |
126.12 |
6.43 |
1.019 |
10.19 |
1.82 |
C |
111.12 |
3.94 |
0.709 |
7.09 |
2.37 |
a..相對克分子校正因子(f′m)的測定標(biāo)準(zhǔn)A,T,G,C混合溶液,在上述色譜條件下進樣,測定每個峰面積。按下式計算A、T、G、C的相對克分子樣正因子(fm)。
f′m(i) | = | AsmiMs |
AimsMi |
式中A峰為面積,m為進樣量,M為分子量,下標(biāo)S為內(nèi)標(biāo)物(本實驗以A為內(nèi)標(biāo)物),i待測堿基。
b.G+Cmol%計算:10μl各樣測樣品進樣后,測出峰面積,乘上相對克分子校正因子(f′m),然后歸一化,用下式
G+C mol% | = | C[3] |
T+C |
計算,求得其分子百分?jǐn)?shù)。
1.4.2 細(xì)菌菌體脂肪酸組成分析 主要參考I toh等方法①標(biāo)準(zhǔn)品的處理 在脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma產(chǎn)品,EC10A偶炭鏈脂肪酸,OC-9奇炭鏈脂肪酸,UN-10不飽和脂肪酸)中加入4ml25%鹽酸-甲醇后,再加入1ml NaCl溶液。用4ml已烷:乙醚=1:1(體積比)溶液萃取3次。有機相用N2吹干,最后用0.5ml已烷定量。取1μl作色譜分析,標(biāo)定各峰位置。②樣品的處理:在干重為10mg~20mg的細(xì)菌中加入生理鹽水1ml,混均后轉(zhuǎn)入磨口玻璃管中。加入含15%NaOH的水-甲醇(體積比為1:1)溶液2~4ml后,在100°C水浴中加熱30min。稍冷后,加入6NHCl,使溶液pH達(dá)2.0。加入25%HCl-CH3OH溶液5ml,100°C水浴加熱15min。冷卻后,用N2吹干HCl至原體積的一半。加入1ml飽和NaCl溶液。用12ml1:1的乙醚-已烷溶液分三次萃取,萃取后的有機溶液放入有塞磨口離心管中。70°C水浴蒸發(fā)溶液至1ml左右。用N2吹至0.5ml左右,加入少量Na2SO4去除殘余水分。4000r/min離心15min后,取上層有機相,加入1ml已烷溶解。取1μl作色譜分析。③氣相色譜測定條件:色譜儀為日本島津公司的GC-9A,色譜柱為2%的OV-101,80~100目,Chromosorb AW,W,DMCS。操作條件:柱溫180°C~230°C,程序升溫,升溫速率4°C/min,進器溫度和檢測器(FIS)溫度為260°C,RANGE=102。氮氣壓力為0.4kg/cm2,速度為30ml/min,空氣壓力為0.3kg/cm2。
1.5 Hp菌體蛋白電泳與與CJ間抗原交叉反應(yīng)
1.5.1 Hp菌體蛋白電脈 ①樣品的準(zhǔn)備:將細(xì)菌菌苔用生理鹽水洗下.在超聲粉碎儀上粉碎(dute cycle 50%,time 6min。Output Control 8,pulse)。然后10000r/min離心10min,4°C。上清蛋白定量。用0.01ml/LpH7.2磷酸緩沖液稀釋至2mg/ml,-20°C保存。②SDS-PAGE:主要參考Blaser的方法。用pH8.3 Tris-甘氨酸作電泳緩沖液:分離膠濃度為10%;每份樣品加20μl;以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(MV17500~94000,中科院上海生化所東風(fēng)試劑廠產(chǎn)品)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白;在10mA恒流下電泳;考馬斯蘭G~250染色。
1.5.2 用Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞與CJ的Penner分型血清作間接血凝,測定Hp與CJ之間的交叉反應(yīng)。①CJ Penner分型血清的準(zhǔn)備:CJ的Penner分型血清(由衛(wèi)生部藥品生物制品檢驗所、上海衛(wèi)生防疫站及蘇州醫(yī)學(xué)院微生物教研室聯(lián)合研制)由蘇州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室提供。先將25個免疫血清分別根據(jù)特異性較強或交叉反應(yīng)較多的血清組合在同一多價血清內(nèi)。共分6組(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ),Penner5,29,45,52型不包括在多價血清內(nèi),每種血清使用時效價稀釋成1:1280二種濃度備用。②Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞的制備a.Hp耐熱抗原制備:將血平板上洗下的28種Hp菌株(菌號:85135A,85158,85130,85132,85155,85138,85084,85067,85031,85070,85093,85120,85157,85071,85123,85141,85113,85134,85070,85117,85142,85134B,85085,85114,85118,85030,85111,85117)的菌液,均調(diào)整至9×109/ml濃度,100°C加熱1h,3000r/min離心沉淀20min。取上清備用。B.羊紅細(xì)胞制備:取新鮮脫纖維蛋白羊血,離心沉淀,棄上清用pH7.0磷酸緩沖液洗3次后,3000r/min離心沉淀10min,棄上清。用PBS配成1%紅細(xì)胞懸液。C.致敏:分別將28種1ml的耐熱抗析與等量1%羊紅細(xì)胞懸液混合均勻置37°C水浴1h。3000r/min離心10min。棄上清。用PBS洗三次,最后配成0.5%致敏紅細(xì)胞懸液。③交叉凝集反應(yīng):用96孔U型塑料板,縱向分別加入Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ組多價血清及5,29,45,52型的單價血清。橫向單行為1:640濃度的血清0.25μl,雙行為1:1280濃度的血清0.25μl。如此準(zhǔn)備好8塊已添加CJ分型血清的96孔塑料板。然后在每兩行為一組的CJ分型血清中加入一種Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞懸液,每孔0.25μl。待28種Hp耐熱抗原致敏的紅細(xì)胞懸液均加妥后,將96孔塑料板均置微型振蕩器上振蕩1min~2min ,使充分混勻。置37°C孵育2h后觀察結(jié)果。根據(jù)凝集程度,以++++、+++、++、+、± -符號記錄結(jié)果。以血清最高稀釋度呈現(xiàn)“++”以上程度凝集者為陽性。如上交叉凝集反應(yīng)中先以多份血清進行粗篩,若效價超過1:1000者,再以單價血清進行分型,效價≥1:1280者作為陽性。
2 結(jié)果
2.1 Hp的基本生物學(xué)性狀
2.1.1 光鏡下形態(tài)結(jié)構(gòu) Hp為“S”形、“U”形或弧形桿菌。菌體寬0.3~0.5μm,長1.5~5.0μm。大多大小均勻,形態(tài)典型,革蘭染色陰性。Hp較CJ/CC稍粗,兩端鈍圓。在陳舊培養(yǎng)物中,Hp常變成圓球體,在革蘭染色下呈現(xiàn)大小不一、染色深淺不均,周圍界較模糊的特征。在胃粘膜活檢標(biāo)本直接涂片中,多數(shù)存在于著色較淺的粘液帶中,常呈魚貫狀排列,在Hp密集處,甚少雜菌混雜,在著色的組織液背鏡下,Hp菌全周圍常呈現(xiàn)有微莢膜樣結(jié)構(gòu)。在病理組織切片中可見,Hp多數(shù)存在胃粘膜上皮細(xì)胞表面,特別是在胃小凹。在病理切片中尚可見到在胃粘膜表面有Hp存在的附近部位常有大量中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤。在胃的腸腺化生區(qū)域很難找到Hp,但是在十二指腸的胃化生區(qū)域卻能找到Hp。
2.1.2 菌落特征及細(xì)菌動力 在微需氧條件下,經(jīng)37°C72h培養(yǎng),Hp形成較小菌落,直徑<1mm,呈灰白或灰色,邊緣整齊,隆起的圓形菌落。打開平皿有一股特異的氣味。新鮮的菌落制成濕片在暗視野下可見Hp呈螺旋狀迅速向前的運動。亦可見翻滾運動。
2.1.3 生化反應(yīng)特征 Hp的生化反應(yīng)特征見表2。Hp均有氧化酶、觸酶、尿素酶、DNA酶、堿性磷酸酶和亮氨酰酞酶,而馬尿酸鹽試驗均陰性,CJ和CC僅有氧化酶和觸酶,而CJ-S131能分解馬尿酸鹽。
2.1.4 Hp對抗生素的敏感性 25株Hp對13種抗菌藥物的藥敏性見表3。
表2 Hp、CJ和CC生化反應(yīng)
試驗 |
Hp-88065 |
Hp-88073 |
Hp-88082 |
CP-88109 |
Hp-88152 |
CJ-S131 |
CJ-3276 |
CC-3278 |
氧化酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
觸酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
尿素酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
DNA酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
堿性磷酸酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
亮氨酰氨酞酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
馬尿酸鹽 |
- |
- |
- |
- |
- |
+ |
- |
- |
表3 25株Hp對13種抗菌藥物的藥敏結(jié)果
抗菌藥物 | MIC(μg/ml) | |
MIC50 | MIC90 | |
潔霉素 |
0.78 |
12.5 |
紅霉素 |
<0.05 |
0.39 |
TMP |
>100 |
>100 |
先鋒霉素V |
0.2 |
25 |
鏈霉素 |
<0.05 |
0.39 |
四環(huán)素 |
<05 |
0.2 |
慶大霉素 |
0.2 |
0.78 |
青霉素G |
<0.05 |
0.1 |
萬古霉素 |
6.25 |
>100 |
多粘菌素B |
6.25 |
50 |
次硝酸鉍 |
3.12 |
25 |
痢特靈 |
<0.05 |
0.2 |
滅滴靈 |
1.56 |
>100 |
從表中可知所有被檢的Hp菌株對紅霉素、鏈霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素G及痢特靈敏感,其中特別是四環(huán)素、青霉素G和痢特靈的敏感性尤甚,MIC90分別是0.2,0.1及0.2。MIC50均< 0.05。Hp對TMP、多粘菌素B、萬古菌素及滅滴靈耐藥,大部分菌株的MIC均>100。
2.1.5 菌種保存 15株Hp菌株,經(jīng)-70°C冰箱保存一年后復(fù)蘇,14株存活,對存活的14株作直接涂片革蘭染色,油鏡檢查,其中的13株形態(tài)不變,1株成圓球體。我們又對這13株進行了氧化酶、觸酶、尿素酶、DNA酶、堿性磷酸酶試驗,13株Hp陽性,這與保存前相同。
2.2 Hp的超微結(jié)構(gòu) 從不同病人胃粘膜上分離得Hp的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本一致,呈”S”形彎曲、弧形或稍直,偶見分枝狀。一般表面較光滑,一端或二端(多數(shù)為一端)具有2~6條帶鞘鞭毛,長度稍長于菌體。帶鞘的鞭毛直徑在30mm左右。每一鞭毛基部與菌體細(xì)胞膜上直徑約50mm的圓球狀結(jié)構(gòu)相連。菌體末端鞭毛基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)內(nèi)側(cè),有一寬達(dá)200mm~400mm的電子密度明顯降低區(qū)域,其基底部無明顯的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)界限。在Hp負(fù)染標(biāo)本中,部分菌株在菌體周圍可見大小均一、排列整齊的上百個“指”狀突起,似直接為外膜的組成部分,與菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)無明顯直接關(guān)系。在參考菌株中,CJ與CC末端呈圓錐體樣,稍尖,頂端明顯地呈吸盤樣結(jié)構(gòu)。CJ與CC均有單根無鞘端鞭毛從頂端的吸盤樣凹陷的中心伸出。鞭毛根部均未見電子密度明顯降低區(qū)域。
在胃粘膜活檢標(biāo)本的超薄片中可見:一般情況下,胃粘膜上皮與粘液層間不存在細(xì)菌。若出現(xiàn)細(xì)菌,常為大小、形態(tài)較統(tǒng)一的、都呈彎曲樣特征的菌群。多聚居在胃小凹中或上皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞連接處,亦常常鑲嵌在微絨毛之間。偶見Hp在局部的胃粘膜上皮上定位似有明顯的方向性。Hp與粘膜上皮的粘附方式有三種:Hp通過鞭毛頂端直接插入或粘附在胃粘膜上皮細(xì)胞表面;Hp菌體懷胃上皮細(xì)胞間保持一定的間距,借無數(shù)的細(xì)絲狀菌毛樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使兩者互相粘附;Hp菌體的部分細(xì)胞壁與胃上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜直接相貼粘附,二者間幾無間距。最多見的是第二形式,有時同一細(xì)菌可同時出現(xiàn)兩種或以上粘附形式。Hp粘附聚居外的上皮細(xì)胞除微絨毛明顯減少或消失外,多數(shù)情況下很少發(fā)現(xiàn)有明顯的細(xì)胞病理學(xué)變化。胃粘膜上皮表面有Hp粘附的鄰近區(qū)域,往往有炎性細(xì)胞的浸潤和滲出。胃粘膜上皮細(xì)胞中尚可偶見對Hp的吞噬現(xiàn)象。
2.3 Hp的DNA+Cmol%和菌體脂肪酸組成
2.3.1 Hp的DNA G+C MOL%含量測得的Hp、CJ/CC DNA G+C mol%含量見表4
表4 Hp CJ/CC DNA G+C mol%含量
菌種 |
Hp-88065 |
Hp-88073 |
Hp-88082 |
Hp88109 |
Hp88152 |
CJ-S131 |
CJ-3276 |
CC-3278 |
DNA |
38.3 |
35.7 |
36.8 |
37.5 |
37.3 |
36.3 |
37.9 |
36.1 |
G+C mol% |
2.3.2 Hp ,CJ/CC菌體脂肪酸的組成 Hp 的脂肪酸組成主要是十九碳環(huán)丙烷酸(19:0cyc)、十八碳酸(18:0)、十八碳烯酸(18:1)和十四碳酸(14:0),CJ/CC的脂肪酸組成主要是十六碳酸(16:0)、十六碳烯酸(16:1)和十八碳烯酸(18:1,表5)。
表5 Hp,CJ/CC菌體脂肪酸組成
菌 種 |
脂肪酸組成(占總%) | |||||||||
14:0 | 15:0 | 16:0 | 16:1 | 17:0 | 18:0 | 18:1 | 18:2 | 19:0cyc | 19:0 | |
Hp-88065 | 18.72 | 1.62 | 3.25 | 0.50 | 0.48 | 16.22 | 21.03 | 2.24 | 24.20 | 3.34 |
Hp-88073 | 4.90 | - | 2.17 | - | - | 26.24 | 39.7 | - | 7.33 | - |
Hp-88082 | 7.29 | - | - | - | - | 25.47 | 22.74 | - | 39.24 | - |
Hp-88109 | 3.68 | 0.87 | 7.02 | 0.63 | - | 21.48 | 31.99 | 2.11 | 27.31 | - |
Hp-8152 | 1.23 | 0.70 | 2.57 | - | - | 29.27 | 23.30 | 3.02 | 39.27 | 0.64 |
CJ-3276 | 1.06 | - | 37.42 | 17.62 | - | - | 38.89 | 3.83 | - | - |
CC-3278 | 6.85 | - | 38.82 | 19.39 | - | - | 30.23 | 2.29 | - | - |
2.4 Hp菌體蛋白電泳與CJ分型血清間的交叉反應(yīng)
2.4.1 CP菌體蛋白SDS-PAGE Hp的主要條帶Mr約為25100,28200,44700,62000,70800,81900,12600七條。CJ/CC條帶相似,其主要條帶Mr約為63000,89100和100000。
2.4.2 CP與CJ抗原交叉反應(yīng) 可見除CJ-22502免疫獲得的Penner45型血清與絕大部分Hp菌株(28株中的19株)及PennerV組多價血清與Hp-85607有較強的交叉反應(yīng)外,其余幾乎無免疫學(xué)上的交叉(表6)。Hp-85067與V組多價血清的因子血清的反應(yīng)結(jié)果見表7。
表7 Hp-85067與V組因子血清間的抗原抗體交叉反
CP菌株 | CJ免疫菌株號 | 78 | 77 | 76 | 75 | 68 | 65 | 22023 |
Penner分型血清 | 37 | 36 | 35 | 34 | 26 | 23 | 4 | |
CP85067 | 1:640 | - | - | +++ | +++ | +++ | - | +++ |
CP85067 | 1:1280 | - | - | +++ | +++ | +++ | - | +++ |
3 討論
3.1 Hp的生物學(xué)地位 雖然Hp引起的世界性關(guān)注及人們對其廣泛研究是在1983年以后,但早在1847年 Bottcher已在人胃中發(fā)現(xiàn)了螺形的細(xì)菌,隨后人們又從許多動物-狗、大鼠、貓的胃中發(fā)現(xiàn)類似細(xì)菌。1906年又從潰瘍性胃癌病人的胃內(nèi)容物中找到這類細(xì)菌。其他一些報告證實在健康人中不易發(fā)現(xiàn)它們。1939年 Doenges在242例人胃尸檢的染色標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有43%存在數(shù)種不同類型的螺形菌,但不明確這些菌與各種胃病間的相互關(guān)系。1954年P(guān)almer在1000例胃活檢標(biāo)本中未能證實上述報告,認(rèn)為前人發(fā)現(xiàn)地螺形菌系吞入或死后污染所致。1975年Steer和Colin-Jones報告了胃潰瘍病人胃粘膜上出現(xiàn)細(xì)菌,經(jīng)分離培養(yǎng),結(jié)果是綠膿桿菌。后人仔細(xì)觀察該文圖片,認(rèn)為胃粘膜上的細(xì)菌是一種與綠膿桿菌無關(guān)的螺形菌。在同一時期,許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種動物胃中存在有內(nèi)源性尿素酶活性。最早是1924年有Luck和Seth描述的,后在1955年Korngerg和Davies的綜述中斷定胃的尿素酶主要存在于胃體部,且是細(xì)菌源性的。在人類胃的研究中證實了這種酶的存在與潰瘍病之間的關(guān)系,有些病人還成功地利用了尿素進行了治療。
1983年Warren從慢性活動性胃炎活檢標(biāo)本的胃粘膜上皮表面發(fā)現(xiàn)了一種未經(jīng)鑒定的彎曲狀細(xì)菌,Marshall又用彎曲菌屬的分離培養(yǎng)技術(shù)從幽門的活檢標(biāo)本中分離培養(yǎng)成功了該菌。由此,曾先后命名為GCLOs和Hp。1984年Langenberg并發(fā)現(xiàn)原先認(rèn)為的胃中內(nèi)源性尿素酶即由此菌產(chǎn)生。因此在1984年以前人們對Hp的生物學(xué)性狀了解得比較少,只知它在光鏡下呈螺形,分離培養(yǎng)需微氧條件,與彎曲菌屬的代表菌種-空腸彎曲菌相似,只是它有較強的尿素酶活性與空腸彎曲菌不同。此后這種細(xì)菌與各種慢性胃病間的密切相關(guān)性為世界各地的學(xué)者所進一步證實。由此掀起了一股對Hp研究的熱潮。
在國內(nèi),我們對Hp表型特征—生物學(xué)性狀的系統(tǒng)研究是比較早的,其結(jié)果已如前述。根據(jù)這些結(jié)果,Hp確實與彎曲菌屬的代表菌種——CJ有一些共同或相近之處,例如光鏡下的形態(tài)相似,都需要微氧的條件分離培養(yǎng),營養(yǎng)要求大致接近。培養(yǎng)的最適溫度雖有差別,但都能在37°C生長,都能產(chǎn)生觸酶、氧化酶,均不能利用糖類,能產(chǎn)生微量的H2S。對各種抗生素的敏感譜與CJ相比,絕對值雖有一些出入,但總趨勢大致相仿。Hp的DNAG+Cmol%與CJ基本相同,甚至重疊在同一范圍內(nèi)。從這些特征,Hp與CJ同歸一屬似乎無可置疑。
俟后,進一步的研究發(fā)現(xiàn)Hp與CJ間存在著更多的本質(zhì)上差別:①有一些重要的生化反應(yīng)與CJ明顯不同,例如尿素DNA酶,堿性磷酸酶、亮氨酰胺酞酶等,Hp均為陽性,而CJ/CC均為陰性,這與國外文獻報道是一致的。②更重要的是在超微結(jié)構(gòu)上Hp與CJ/CC存在著不同,特別是鞭毛、鞭毛的根部和菌體末端的外形其內(nèi)側(cè)具有“極膜”,曾提出它可能與水螺菌(Aquaspirillum,AS)同屬。但不久發(fā)現(xiàn)AS為雙極叢毛菌,一般每端只有1~2根鞭毛,Hp雖偶也可見雙極鞭毛,但多數(shù)情況下只有一端有鞭毛,且為有鞘鞭毛,數(shù)量多到6根。更重要的原因是因為AS的DNA G+Cmol%為49~66,與Hp相關(guān)甚大。很快就不再有人提及。③從所測的Hp菌體脂肪酸組成來看,Hp與CJ/CC之間亦存在著明顯差別,它們的主峰是各不相同的,這一特征與國外文獻報道基本一致,只是我們Hp的幾個主峰間的相對值與國外報道者略有上下,推測可能是地方菌株之間的差異。④按菌體蛋白電泳的主要蛋白條帶,Hp與彎曲菌屬的主要代表菌種之間亦存在明顯的不同,Hp有7條主要條帶,CJ/CC僅有3條,其中只有分子量為63000與89100的2個條帶基本相同。⑤根據(jù)Hp耐熱抗原與CJ的Penner分型血清的交叉反應(yīng),它們之間亦不存在有明顯的交叉抗原,其中有一個值得討論的問題是由CJ22052菌株免疫得的Penner45型血清與28株Hp菌之間有18株發(fā)生明顯交叉反應(yīng)。我們深感這一現(xiàn)象奇特,特地對22052菌株作了深入一步的研究,發(fā)現(xiàn)它在基本生物學(xué)性狀方面確實與CJ類似,但在電鏡下其菌體末端及鞭毛的特征與C明所不同。更重要的是DNA G+Cmol%僅有27.8,明顯地超越彎曲菌屬范圍。因此,若22052菌株不屬于彎曲菌屬,則Hp與CJ之間基本上不存在耐熱抗原的交叉。至于Hp85067菌株與的Penner26,34,35型血清之間的交叉凝集原因未明,有待進一步作出解釋。
表8 Hp與CJ/CC.CF菌體末端擴鞭毛的超微結(jié)構(gòu)比較
菌種 | 菌體末端 | 鞭毛特征 | 鞭毛根部特征 | |||
外形* | 頂端 | 內(nèi)側(cè) | 數(shù)量*鞘 | |||
吸盤樣凹陷 | 電子密度降低區(qū) | |||||
CP | 純圓 | - | + | 2~6 + 末端球形或脫鞘狀 | 每一鞭毛在菌體細(xì)胞膜上有一圓球狀根基 | |
CJ/CC | 圓錐狀 | +* | - | 1 | - | 鞭毛從吸盤樣凹陷中央伸出未見圓球狀根基 |
CF | 稍鈍圓 | + | + | 1 | - | 同CJ/CC |
*國外文獻中亦有同樣報道,其他特征尚未見文獻報道。
綜上所述,從Hp的各方面的表型特征來看,Hp與彎曲菌屬的代表菌各:CJ22052菌株菌體末端超微結(jié)構(gòu)(×60000)-CJ、CC之間,差異性多于共同性,且其差異點比共同點更具有本質(zhì)性。因此,我們贊同國外個別學(xué)者提出的Hp不歸入彎曲菌屬,而宜另立一個新屬的主張。
至于Hp究竟應(yīng)歸入哪屬細(xì)菌,Romaniuk從分析Hp,多種彎曲菌屬細(xì)菌和產(chǎn)琥珀酸沃林菌(Wolinella succinogenes,WS)等的16s rRNA核苷酸序列得出結(jié)論,認(rèn)為Hp與彎曲菌屬關(guān)系較遠(yuǎn),而與WS關(guān)系較近,似乎應(yīng)與WS同歸一屬。但Hudson則認(rèn)為Hp在DNAG+Vmol%(36%~38%對 46%~49%),脂肪酸組成,極性脂質(zhì)(polar lipid),總蛋白電泳譜和它同時具有MK-6及TPQ-6方面與WS不同,因此不宜歸入沃林氏屬,他認(rèn)為根據(jù)Hp的培養(yǎng)和形態(tài)的基本特征仍應(yīng)歸入彎曲菌屬為宜。遺憾的是迄今還沒有一個比較統(tǒng)一的能夠應(yīng)用于所有細(xì)菌的細(xì)菌學(xué)命名原則,因此對有一些難于命名的細(xì)菌免不了會引起一些爭論。雖然現(xiàn)在對有一些細(xì)菌的研究已經(jīng)開始邁入了分子遺傳學(xué)的領(lǐng)域,但是當(dāng)前以表現(xiàn)型特征作為分類的主要依據(jù)仍然無可置辯地具有更現(xiàn)實的意義。雖然幾乎收集了當(dāng)今世界上彎曲菌屬所有的15種菌種,甚至包括Hp和WS,進行了16s r RNA核苷酸順序的分析 。根據(jù)同源性的程度不同將它們分成三群,可是他不得不承認(rèn)由于缺少對彎曲菌屬各種菌種表現(xiàn)型特征的全面了解和也由于沒有將所有的細(xì)菌都用同樣的試驗和同樣的方法比較過,因此難于對三群細(xì)菌作出適當(dāng)?shù)膶iT的描述。Good-win認(rèn)為由于Hp在臨床上的重要性,急需把它命名學(xué)地位及早地確定下來,他對Hp、WS和彎曲菌屬細(xì)菌作了超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)、菌體脂肪酸組成、甲苯醌、生長特征和酶的活力五個方面的表現(xiàn)型特征作了研究,他的結(jié)論是Hp不應(yīng)歸入沃林菌屬,他提出給它命名為Helicobacter pylori(暫譯為幽門螺桿菌)。我們的意見偏向于贊同他的意見,因為我們亦對一部分細(xì)菌作了系統(tǒng)的表現(xiàn)型特征的研究,除了甲苯醌我們沒有做以外,我們還做了DNA G+Cmol%,菌體蛋白蛋電泳分析和與CJ的Penner分型血清之間交叉反應(yīng)的研究,大部分結(jié)果都表明,Hp與CJ之間有明顯的不同。
3.2 Hp的致病性 自從Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)Hp后,世界各地學(xué)者相繼從各種慢性胃病及十二指腸潰瘍病人的活檢標(biāo)本中找到了Hp,且檢出率都很高,從而初步確定了Hp與各種慢性胃病的密切相關(guān)性。1985年Marshall按照Koch的病原體致病性原則,吞服了Hp菌液作了自身感染實驗。二位學(xué)者先后都找到了Hp在自身引起急、慢性胃炎的證據(jù)。1987年Krakowka又以悉生小豬(Gnotobiotic piglet)口飼Hp菌液液造成Hp感染的動物模型。至此,Hp直接或間接與各種慢性胃病有關(guān)已得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可。但Hp的致病物質(zhì)和致病機制,迄今尚未闡明。我們從超微結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)了一些在國內(nèi)外文獻中尚未作報道的現(xiàn)象,并結(jié)合光鏡下的觀察所見和一些有關(guān)文獻,對Hp的致病機制或致病過程作出如下推斷。
胃是人們對攝入的食物徹底消化前進行預(yù)處理的重要器官。在預(yù)處理過程中,偽造胃壁肌肉收縮和舒張的物理和機械作用使食物在胃中受到胃酸和胃蛋白酶的強烈化學(xué)作用而得到初步消化。本來胃的這種強力的縮舒運動及強酸,酶類作用對胃壁本身就可能造成損傷作用,但由于在胃壁粘膜表面有一層較厚的、且在不斷代謝更新的不溶性粘液連續(xù)層存在,且在其表面尚有可溶性粘液層起著滋潤作用,因而保護了胃粘膜。為何經(jīng)口入胃的過路細(xì)菌很多,而獨有Hp能透過不溶性粘液層定居于胃粘膜上皮表面?為何Hp對人胃的感染率這么高,而在不溶性粘液層下胃粘膜上皮表面幾乎找不到有第二種細(xì)菌的大量存在?為何一個人一旦被Hp感染后,Hp能長期在胃中持續(xù)存在?為何用有效抗生素治療常不能徹底殺滅胃粘膜上的Hp?所有這些問題都說明Hp的感染有其獨特性。根據(jù)我們所觀察到的Hp與胃粘膜之間有關(guān)系特別是Hp的三種粘附現(xiàn)象,我們提出Hp感染過程的假說如下。
第一步,Hp利用其特征性的菌體和鞭毛結(jié)構(gòu)穿透不溶性粘液層,當(dāng)Hp隨食物進入胃中,首先偽造其鞭毛與胃粘膜表面的不溶性粘液層發(fā)生親和性吸附。在不斷運動著的胃壁上初步找到了一個落腳點。然后借其菌體的螺形結(jié)構(gòu),以及一端有數(shù)根象推進器樣活潑運動的鞭毛使它在粘稠的不溶性液層中自由泳動。Venables報道,胃粘膜上的不溶性粘液層的化學(xué)結(jié)構(gòu)是由二硫鍵連接的四個同等大小的亞單位組成的多聚體糖蛋白構(gòu)成的。每一個亞單位以蛋白質(zhì)為核心,四周圍繞有碳水化合物的側(cè)鏈,形似“瓶刷狀”。 Hp利用其菌體及鞭毛結(jié)構(gòu)上的特點可在這種平行排列的“瓶刷狀”結(jié)構(gòu)中作螺旋形的向前運動。
Hazell曾在模擬的粘稠環(huán)境中發(fā)現(xiàn)Hp比同樣具有鞭毛的大腸桿菌的泳動速度快10倍。這就說明了在食物經(jīng)過胃的短暫時間內(nèi),為何幾乎只有Hp能透過不溶性粘液層,而其它細(xì)菌很難通過的重要原因。
第二,Hp依靠其菌體表面菌毛樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定地定居于胃粘膜上皮細(xì)胞表面,Hp透過不溶性粘液層后首先仍然通過鞭毛在粘膜上皮表面“拋錨”。然后菌體迅速向粘膜上皮表面靠攏。偽造其菌體表面菌毛樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(或稱糖萼Glycocalyx)與胃粘膜上皮細(xì)胞表面緊密相連,達(dá)到比較穩(wěn)定地固定在胃粘膜上皮的局部。這Hp特異性地只在胃粘膜組織或腸及食管胃化的組織上定居,而不在其他組織上定居的原因,可能在胃粘膜組織上存在有Hp的特異性受體之故。正由于它存在著特異性的較強的粘附機制,因此盡管不溶性粘液層和胃粘膜上皮以較快的速度不斷代謝更新,一部分Hp隨著表面的粘膜上皮和不溶性粘液層的更新而脫落,但總還是有一部分Hp在胃的不斷運動中在就近的新生的粘膜表面或不溶性粘液層找到繼續(xù)定居的場所。這就是造成人類的胃粘膜一旦被Hp感染后,Hp就較難以徹底消除的緣故,結(jié)果易形成持續(xù)感染的狀態(tài)。這也是人胃的Hp感染率為何這么高的原因。
第三步,Hp部分細(xì)胞壁與胃粘膜上皮細(xì)胞直接相貼,依靠其脂多糖與細(xì)胞毒素等引起胃壁的病變,Hp的感染還不等于發(fā)病,只有在某種尚待探明的因素影響下,Hp菌體的部分細(xì)胞壁與胃粘膜上皮細(xì)胞直接相貼的第三種粘附機制過渡后,才由于細(xì)胞壁(這時Hp已失去包在菌體外面的一層外膜樣結(jié)構(gòu))脂多糖的內(nèi)毒素樣作用引起局部粘膜樣結(jié)構(gòu))脂多糖的內(nèi)毒素樣作用引起局部粘膜的炎癥。另外,粘膜上皮表面大量Hp還可能由于所產(chǎn)生的強有力的尿素酶分解尿素后產(chǎn)生的氨離子阻擋H+從胃腺向胃腔通過。胃蛋白酶對粘液素的降解,細(xì)胞毒素對細(xì)胞的毒性作用等導(dǎo)致粘膜的潰瘍。胃炎可能是潰瘍的基礎(chǔ),反過來,潰瘍又可能促進胃炎,因此慢性胃病中的胃炎和潰瘍兩種基本類型都與Hp感染的直接或間接作用密切相關(guān)。Hp在體外對許多抗生素是敏感的,但是由于種種原因真正能用于胃部疾病治療的抗生素是有限的,即使有效的抗生素,由于不溶性粘液層的保護作用,亦很難將Hp徹底消滅干凈。
張振華
上海第二醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室(200025)