3.肽段的分離
大部分肽段的分離主要通過凝膠過濾法，由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有機溶劑使之溶解。單用凝膠過濾法分離之肽一般純度不高，常需輔以離子交換層析法，大片段肽可用離子交換葡聚糖作載體，小肽則多用Dowex-50等樹脂。
小肽分離還常采用高壓電泳與層析相結(jié)合的指紋圖譜法，得到純凈肽。
4.肽的順序分析
在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定中，肽的順序分析是比較重要的一步。肽的順序分析也有化學(xué)法和酶解法兩種。
1)化學(xué)法Edman降解法
這是目前用于順序分析的最主要的方法。它的原理是從N端開始，逐步降解。將肽先與異硫氰酸苯酯(PTH試劑)在pH8-9條件下作用，肽的NH2末端接到異硫氰酸苯酯的C原子上生成苯異硫甲氨酰肽，簡稱PTC肽，在強酸作用下，可使靠近PTC基的氨基酸環(huán)化，肽鍵斷裂形成苯氨基噻唑啉酮衍生物和一個失去末端氨基酸的肽鏈。此肽不被破壞，因而又可出現(xiàn)一個新的N－末端。重復(fù)以上的步驟，繼續(xù)與PTH試劑作用，繼續(xù)分析，苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有機溶劑抽提出來進行鑒定。但此衍生物很不穩(wěn)定，在水中可轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。這些步驟通常稱為Edman氏逐步降解法。所以可用來測定氨基酸的排列順序。Edman降解法的優(yōu)點是樣品用量少，靈敏度高。
PTH－氨基酸的鑒定可以用各種層析方法，如紙層析、薄層層析、氣相層析和質(zhì)譜法等，現(xiàn)在多用高壓液相層析法。雖然此方法具有很多優(yōu)點，但是由于操作繁瑣，工作量大，所以目前有人根據(jù)Edman降解的原理作一系列改進。
下面簡單介紹幾種方法
A.1967年Edman及Begg介紹了一種Edman降解的液相自動分析裝置，使順序分析開始走向自動化。將樣品先在反應(yīng)杯內(nèi)旋轉(zhuǎn)成薄膜，使之固定。然后與PITC試劑反應(yīng)。再用有機溶劑多次抽提除去過剩試劑，因而樣品易丟失，且儀器昂貴，使用受到限制。
B.1970年Laursen改進為固相氨基酸順序儀。此法樣品用量少，檢出靈敏，可分析20?0肽，其原理是將肽共價結(jié)合到惰性支持物上，固定后裝柱再行Edman降解。
固相順序儀的惰性支持物有：
此法成功的關(guān)鍵是肽段的固定，目前采用C端α羧基固定法，重復(fù)法高，其中以高絲氨酸內(nèi)酯法及雙異硫氰酯法(DITC)最好，固定率可達90-95%。
C.另外也有從化學(xué)反應(yīng)的角度考慮，試圖改進Edman方法。1976年有人將異硫氰酸苯酯的苯基改變?yōu)榧装迸嫉�，試劑為甲氨偶氨苯異硫氰酸鹽(簡稱DABITC)。這是一種有色試劑，產(chǎn)物DABIH氨基酸呈桔黃色，因此鑒定時無需染色，用肉眼即可分辨。此方法靈敏度很高，一次分析小肽段只要幾個nanomole樣品即可，是目前一種很可取的方法。此外也有人將異硫氰酸酯進行35S標(biāo)記，使分析樣品更向微量化方向發(fā)展。
