三、凝集素在免疫細胞化學中的應用
凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標記,分別進行下列染色法:
1.直接法 標記物直接標記在凝集素上,使之直接與切片中的相應糖蛋白或糖脂相結(jié)合。
。1)切片脫蠟至水。
。2)凝集素標記物(100μg/ml),室溫,30min。
。3)TBS洗3次,每次2min。
(4)如為熒光素標記物,封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標記物,則應依次進行呈色、脫水、透明和封固后在光學顯微下觀察。醫(yī).學全.在.線m.bhskgw.cn
直接法的優(yōu)點是簡便,目前商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。
2.間接法 將凝集素直接與切片中的相應糖基結(jié)合,而將標記物結(jié)合在抗凝集素抗體上。
。1)脫蠟至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
(3)凝集素稀釋液(100μg/ml)孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次2min。
。5)用標記了的抗凝集素抗體(1:100)孵育30min。
。6)TBS洗3次,每次2min。
(7)呈色、脫水、透明、封片。
。8)觀察。
間接法染色還可進一步改良為:①三步法:即在凝集素孵育后,接著用抗凝集素抗體孵育,再用標記了的抗-抗凝集素抗體孵育,層層放大,進一步提高其敏感性,PAP復合物也可作為標記物標記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法:用結(jié)合了生物素的凝集素孵育切片后,TBS洗后再以抗生物素—標記物與之結(jié)合。間接法較直接法和直接法敏感性高5~10倍或更多一些,但必須購買或自制抗凝集素抗體。
3.糖—凝集素—糖法 本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合。經(jīng)沖洗后,凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位,將這些部位與有過氧化物酶標記的特異性糖基相結(jié)合,形成一個三明治樣的糖—凝集素—糖的結(jié)合物。
(1)脫蠟至水。
(2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
(3)用100μg/ml的凝集素孵育30min。
(4)TBS洗3次,每次3min。
。5)用100μg/mlHRP標記的糖液孵育30min。
。6)TBS洗3次,每次3min。
。7)DAB呈色、脫水、透明、封固。
本法特異性強,靈敏度高,因為這不象生物素—抗生物素法那樣要改變凝集素,又不需要像抗體那樣要制備抗體。HRP本身含有甘露糖,能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結(jié)合。但對其它的凝集素,本法目前普及還有一定困難,因為要將過氧化物酶結(jié)合到其它凝集素上,就需要將一個適當?shù)奶妓衔锘鶊F嵌入過氧化物酶,稱為糖基化(glycosylation),方法雖不復雜(Lee 等1976),但需一定的試劑和設(shè)備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限。
【注意事項】
、倌匦枰亟饘匐x子維持其活躍的結(jié)合部位,如果金屬離子耗盡了,就會影響凝集素的結(jié)合能力。因此,有作者主張用TBS作為緩沖液,內(nèi)加微量的金屬,配方是:Tris 60.57g,NaCl87g, H2O加至1000ml,其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L;蛟谶M入凝集素孵育前,先用該液孵育,以增強凝集素結(jié)合力。
、诤推渌贵w血清應用一樣, 應用每批新的凝集素實驗時,都先要用緩沖液稀釋成不同等級;如8,16,32,64,125,250,500,1000μg/ml,經(jīng)染色選擇最佳稀釋度。
③有作者認為阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶所用的H2O2對碳水化合物有影響,可能改變凝集素的結(jié)合形式,因此,應盡量少用或不用,我們及一些作者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)影響不明顯。
④有作者認為凡經(jīng)固定的組織切片,不論是石蠟包埋切片或冰凍切片,都有可能使組織中抗原隱蔽,為了暴露隱蔽了的碳水化合物基團,主張在凝集素孵育前用酶處理切片,常用胰蛋白酶液(配制見附表)進行適當?shù)姆跤?/P>
⑤已知哺乳動物的質(zhì)膜含有占蛋白總量的1%~10%的碳水化合物,它們以低聚糖(oligosacchride)糖脂,并主要以糖蛋白的形式存在,糖蛋白線性的或分支的旁鏈可能含有兩個到多個單糖殘基,通常有兩種或更多的單糖,在單糖單位末端常常是一個帶負電荷的N-乙酰神經(jīng)氨酸的殘基,一個唾液酸(siallic acid)。有作者在凝集素實驗中常用神經(jīng)氨酸酶(neuramidinase)分解細胞表面的唾液酸或神經(jīng)氨酸,以暴露出隱蔽的能與聚集素結(jié)合的次終末的碳水化合物。配制方法是將神經(jīng)氨酸酶(Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172)用醋酸緩沖液(含2%牛血清白蛋白)BSA配成0.5μg/ml。
切片脫蠟后進行酶消化的過程中,將該組織切片置于上述配制液中,在濕盒內(nèi),37℃孵育30min。用緩沖液洗后,進行凝集素染色。
、迣φ赵囼灒推渌M化染色一樣,凝集素染色也需要設(shè)對照試驗(最好在相鄰切片進行)。由于凝集素具有單糖特異性,如果外加相應的糖,把凝集素的結(jié)合部位占有了,凝集素就不能再與組織中的糖基相結(jié)合了。一般采用的方法是將凝集素預先與相應的糖(0.2mol/L)在室溫孵育30min,使之占有凝集素結(jié)合部位,再將此液代替凝集素進行孵育,結(jié)果應為陰性。在某些情況下即使提高糖液的濃度也不能達到完全的抑制。這時,只有用與凝集素有高親合力的低聚糖(oligosachrides)代替或?qū)⑶衅A先用相應的糖苷酶孵育去除特異性糖基(Watanalte等,1981)。