近年免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在下述方面的應(yīng)用令人注目，有著廣闊的前景。現(xiàn)介紹如下：
一、ICC在鋪片中應(yīng)用
鋪片（Whole Mount Stretch Preparation) 是研究神經(jīng)分布應(yīng)用較早、較廣的方法。19世紀(jì)末，Dogiel和Cajal等利用鋪片技術(shù)，結(jié)合鍍銀及甲基藍(lán)染色，觀察腸道神經(jīng)叢模式、神經(jīng)元種類(lèi)及其相關(guān)聯(lián)的間質(zhì)細(xì)胞。近年來(lái)，人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到全層鋪片技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：例如①不必采用連續(xù)切片和三維重建技術(shù)，可以直接觀察神經(jīng)元間質(zhì)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)；②能觀察較大區(qū)域，在研究顯微外科手術(shù)后神經(jīng)分布模式和數(shù)量改變中有較好的應(yīng)用價(jià)值；③操作簡(jiǎn)單，能在較短時(shí)間內(nèi)制作大量標(biāo)本等。所以，鋪片技術(shù)在ICC染色中得到廣泛的采用（Zhou等1992)
鋪片ICC染色方法與切片基本相同，所不同的是鋪片較厚，背景著色較強(qiáng)，有時(shí)甚至妨礙特異性染色的觀察。實(shí)驗(yàn)證明，這種非特異性染色主要是酶標(biāo)抗體/橋抗體與組織γ-球蛋白結(jié)合引起的，用封閉性阻斷劑及正常血清等分別孵育切片，并在稀釋抗體時(shí)，加入適量的BSA，可以降低此類(lèi)非特異性結(jié)合。BSA、封閉性阻斷劑與IgG（正常血清)的等電點(diǎn)不同，重疊應(yīng)用，阻斷效果尤佳。另外，鋪片的細(xì)胞膜完整，不利于抗體的穿透，特別是PAP復(fù)合物等大分子物質(zhì)，為此設(shè)法提高抗體的穿透性是非常重要的。采用反復(fù)凍融和表面活性劑前處理，有助于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴露。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中參考Costa(1980)的制片方法，將組織鋪片經(jīng)系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次10～15min)脫水，Hemo—d 2次（10～15in/次)，再水化（100%、90%、70%、50%降酒精)等處理，輔助Triton X-100應(yīng)用，明顯增加抗體的穿透性，獲得較為滿意的染色效果�！ 〉�，并非所有的組織都能制成鋪片，虹膜、腸系膜和小血管等適于制做全層鋪片；食道、胃腸道、膽道、膽囊、大血管、輸尿管等臟器則均需進(jìn)行組織分層，再鋪片，行ICC染色。
染色方法：以小腸分層鋪片為例：
�。�1)4%多聚甲醛或Zamboni 液固定2～6h，4℃，或丙酮固定。
�。�2)PBS充分沖洗，置PBS中過(guò)夜。
�。�3)系列酒精脫水，Hemo—D透明，降酒精至PBS。
（4)分層鋪片，直接漂浮染色或貼于載玻片風(fēng)干，再染色。
�。�5)0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室溫，PBS沖洗。
�。�6)封閉性阻斷劑30in，室溫，正常兔（羊)血清30min，室溫。
（7)第一抗體，孵育，4℃冰箱過(guò)夜；PBS2次/2min；重復(fù)第一抗體孵育（可稀釋1
倍)，2～3h，室溫，充分使抗體穿透至深層，使組織深層的抗原得以與抗體充分結(jié)合。
�。�8)PBS充分沖洗，2～3h，4℃。
�。�9)酶標(biāo)抗體孵育，4℃冰箱過(guò)夜。
�。�10)PBS沖洗，呈色，觀察與切片相同。
二、ICC的雙重染色法
在某些物質(zhì)活性檢測(cè)、神經(jīng)遞質(zhì)共存的研究、臨床腫瘤的分型、定性，以及預(yù)后的估測(cè)等中，ICC顯示了巨大的優(yōu)勢(shì)，它不僅能與Carbon、熒光色素、同位素追蹤標(biāo)記及其它組織化學(xué)方法（例如PAS染色法)結(jié)合，顯示兩種物質(zhì)的共存，提示組織細(xì)胞的功能，而且本身亦可進(jìn)行雙重染色，研究一些抗原物質(zhì)的共存，這里僅簡(jiǎn)單介紹ICC雙重染色的幾種方法。
�。ㄒ�)切片
1．連續(xù)切片（Serial sectioning technique) 連續(xù)切片是兩種物質(zhì)共存研究中應(yīng)用最早的方法之一，是用相鄰切片分別孵育兩種不同特異性抗體進(jìn)行ICC染色，主要適用于觀察同一細(xì)胞內(nèi)不同抗原的分布。該方法要求切片足夠薄，保證每個(gè)細(xì)胞能同時(shí)出現(xiàn)在3～4張相鄰切片上，第1和3張切片用相同抗體染色均陽(yáng)性時(shí)，作為陽(yáng)性結(jié)果，可信度較高，可避免結(jié)果判斷困難。所以，常采用石蠟切片，厚約2μm左右，若用樹(shù)脂包埋的半薄切片（0.5～1μm)，比較容易識(shí)別同一細(xì)胞內(nèi)兩種抗原的共存。
2．鏡影切片法（Mirror sectioning technique) 所謂鏡影切片，簡(jiǎn)單地講就是兩張相鄰的石蠟切片（厚2μm)或冰凍切片（厚3～4μm)，第二張反轉(zhuǎn)之，貼于載玻片上，同一細(xì)胞在兩張相鄰的切片上呈鏡與影的關(guān)系（相當(dāng)于冰凍蝕刻電鏡的P面和E面)。分別孵育兩種不同抗體，ICC染色，觀察其在同一細(xì)胞內(nèi)的分布。
（二)染色
1．ICC與熒光抗體法結(jié)合 首先染色顯示A抗原，DAB/H2O2呈色，繼之用間接（直接)熒光抗體法顯示B抗原，于光鏡和熒光顯微鏡下觀察，比較兩種抗原的分布。因DAB終產(chǎn)物能夠沿其表面向周?chē)w移，尤其是DAB濃度略高、反應(yīng)時(shí)間稍長(zhǎng)時(shí)，形成的終產(chǎn)物較大，可以遮蓋該抗原抗體的反應(yīng)部位，故兩種染色間很少出現(xiàn)交叉反應(yīng)。該雙重染色的方法主要適于顯示兩種抗原分布不同細(xì)胞內(nèi)，尤其A抗原濃度高、反應(yīng)較強(qiáng)、DAB終產(chǎn)物較牢固的情況。
2．同一切片的再度染色法（Restanining Method) 用ICC法顯示神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽等在神經(jīng)細(xì)胞/神經(jīng)纖維內(nèi)共存時(shí)，連續(xù)切片、鏡影切片及重疊染色往往很難判斷同一神經(jīng)纖維的共染，為此建立了同一切片再度染色法。該方法利用4—氯—1—萘酚（CN)產(chǎn)物在酒精內(nèi)的可溶性及酸處理能使抗原抗體解離的特點(diǎn)，首先第一種抗原用CN發(fā)色，染色陽(yáng)性部位攝影；繼之，用低 pH的甘氨酸/鹽酸緩沖液（0.2mol/L甘氨酸—鹽酸緩沖液，pH2.2～2.3,含0.5mol/l NaCl)或鹽酸孵育切片，去除第一次染色的抗體，再經(jīng)50%、70%、90%、100%酒精脫CN色，PBS洗凈后染色第二種抗原，DAB呈色后，攝影比較同一部位是否兩種抗原共存在于同一神經(jīng)纖維。為驗(yàn)證鹽酸等處理效果，可省略第二次染色的特異性抗體，僅重復(fù)酶標(biāo)抗體的染色，觀察第一抗原陽(yáng)性部位是否出現(xiàn)重疊著色。醫(yī)學(xué)全.在線m.bhskgw.cn
3．同一切片、不同呈色的雙重染色I(xiàn)CC法顯示A抗原時(shí)，用DAB/H2O2呈色，終產(chǎn)物為棕褐色；繼之，B抗原染色，CN/H2O2呈色，反應(yīng)產(chǎn)物深藍(lán)色，光鏡下可同時(shí)觀察兩種抗原的局部所在。為避免第二次染色的抗體與第一次染色抗體之間的交叉反應(yīng)，在B抗原染色前，可用酸性緩沖液處理切片，去除第一次反應(yīng)的抗體，方法同2。該方法DAB和CN的色彩對(duì)比不鮮明，而且HRP酶活性較強(qiáng)，酸性緩沖液中，亦能殘存部位活性，所以可能有混合顏色出現(xiàn)，判定同一細(xì)胞內(nèi)兩種抗原共存常常有一定難度。
4．兩種酶標(biāo)抗體的雙重染色 分別用HRP和ALP標(biāo)記間接抗體，ICC染色，顯示兩種不同的抗原。首先顯示A抗原，HRP酶標(biāo)記間接抗體，CN/H2O2呈色；繼之顯示B抗原，ALP標(biāo)記間接抗體，F(xiàn)R/As—Mx呈色，輕度甲基綠/蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，一般可獲得理想的結(jié)果，組織結(jié)構(gòu)清晰，色彩對(duì)比鮮明。筆者應(yīng)用此方法，顯示小鼠脾臟巨噬細(xì)胞標(biāo)記物ED1、ED2和ED3分布時(shí)，得到了較佳的染色效果。盡管該雙重染色法應(yīng)用了不同的酶標(biāo)抗體，但常用其二者來(lái)自同一種屬的抗體，所以在第一次染色部位，往往有重疊染色的現(xiàn)象。我們的經(jīng)驗(yàn)為先染色反應(yīng)較弱、含量較少的抗原，第一抗體用較高稀釋度，酶標(biāo)抗體則用高濃度（低稀釋度)，盡量使所有的第一抗體均被飽和，防止其與第二種酶標(biāo)抗體結(jié)合；第二種抗體染色前，應(yīng)用PBS充分洗凈；第二種酶標(biāo)抗體可用較高的稀釋度。這樣可避免“非特異”性重疊著色，色彩對(duì)比亦較理想。
5．不同種屬來(lái)源的抗體的雙重染色 上述幾種雙重染色法，均系來(lái)自同一種屬的特異抗體和相同/不同的酶標(biāo)抗體，所以兩次染色間常常有交叉反應(yīng)。較理想的方法是用不同種屬動(dòng)物制備特異性抗體和兩種酶標(biāo)抗體的雙重染色，例如顯示A抗原為小鼠單克隆抗體，HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG；顯示B抗原為豚鼠單克隆抗體，ALP標(biāo)記羊（驢)抗豚鼠IgG ，將兩種抗體稀釋最佳工作液濃度1/2，充分混合、孵育同一張切片，亦可分別染色。CN/H2O2呈色后，F(xiàn)R—As—Mx呈色，光鏡下觀察兩種抗原的分布。該方法兩種抗體間無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較高，即使細(xì)胞內(nèi)抗原量較少也能發(fā)現(xiàn)。但當(dāng)兩種抗原存在同一部位，其中之一濃度較高、占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)，亦將妨礙另一種抗原的染色，此種情況應(yīng)分別染色，首先染色含量較少的抗原，再顯示含量豐富的抗原。該方法要分別制備4種不同的特異性抗體和酶標(biāo)抗體，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，實(shí)際應(yīng)用受一定限制。
上述兩種雙重染色，兩種酶標(biāo)抗體的非特異性著色可能迭加，致使背景著色較單獨(dú)使用時(shí)增強(qiáng)，S/N下降，所以各研究室應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜅l件，合理選擇染色方法為宜。簡(jiǎn)述染色步驟如下：
�。�1)切片準(zhǔn)備同一般間接法。
�。�2)切片孵育A抗原，特異抗體1～2h室溫。
（3)PBS沖洗，孵育HRP標(biāo)記抗體45min，室溫。
�。�4)PBS沖洗，孵育B抗原的特異抗體1～2h，室溫。充分漂洗，孵育ALP標(biāo)記抗體，45～60min。
（5)PBS沖洗，Baker’液固定5min，室溫，PBS洗凈。
�。�6)呈色CN/H2O2/TBS 15min，室溫。
�。�7)Tris—HCl(pH9.0)沖洗后，F(xiàn)r AS—Mx呈色8min,37℃。
�。�8)輕度PBS沖洗，1%戊二 醛固定5min。
�。�9)水洗，輕度復(fù)染細(xì)胞核，水溶性封固劑封片。
�。�10)光鏡下觀察。雙重標(biāo)記細(xì)胞呈暗紅至深紫色，與單獨(dú)陽(yáng)性細(xì)胞有明顯區(qū)別。
