實(shí)驗(yàn)十 腸桿菌科
腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和動(dòng)物腸道中、生物學(xué)性狀相似的革蘭陰性桿菌。多數(shù)為腸道的正常菌群，但在機(jī)體免疫力低下或寄居部位發(fā)生改變時(shí)可引起感染。根據(jù)其生化反應(yīng)、血清學(xué)試驗(yàn)、DNA同源性等可將腸桿菌科分為120多個(gè)菌種，其中與醫(yī)學(xué)密切相關(guān)的有埃希菌屬、志賀菌屬、沙門(mén)菌屬等。
一、大腸埃希菌
大腸埃希菌(E. coli)俗稱大腸桿菌，是寄居于人和動(dòng)物腸道的正常菌群。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降、該菌侵入腸外組織或器官，可引起急性炎癥或繼發(fā)感染；有些血清型可引起腹瀉。從水和食品中檢出較多大腸桿菌時(shí)，可判斷它們已被糞便污染。因此，大腸桿菌常被作為飲水、牛乳及食品的衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．大腸桿菌革蘭染色標(biāo)本片。
2．大腸桿菌普通瓊脂平板、SS平板、中國(guó)藍(lán)平板、伊紅美藍(lán)(EMB)平板培養(yǎng)物。
【結(jié)果】
1．大腸桿菌為革蘭陰性、中等大小桿菌，兩端鈍圓或稍彎曲，呈分散排列。
2．菌落特征(表10-1)。
表10-1 大腸桿菌在普通瓊脂平板及選擇鑒別培養(yǎng)基上的菌落特征
培 養(yǎng) 基 菌 落 特 征
普通瓊脂平板 圓形，中等大小，灰白，整齊，光滑菌落
SS平板呈紅色
中國(guó)藍(lán)平板 呈藍(lán)色
伊紅美藍(lán)平板呈紫黑色，有金屬光澤
（二) 生化反應(yīng)
【材料與方法】
1．取大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。
2．取大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌分別接種于雙糖鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。
3．靛基質(zhì)產(chǎn)生、甲基紅、VP、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(IMViC試驗(yàn))，見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四。
【結(jié)果】
大腸桿菌生化反應(yīng)結(jié)果(表10-2)。
表10-2 大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌5種糖發(fā)酵、雙糖鐵、IMViC試驗(yàn)結(jié)果
葡 乳 麥 甘 蔗 吲哚 甲基紅 VP 枸櫞酸鹽
乳 H2S 葡 動(dòng)力
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大腸桿菌 ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ d + - ⊕ + + + - -
產(chǎn)氣桿菌 ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ + + - ⊕ + - - + +
二、沙門(mén)菌屬
沙門(mén)菌屬(Salmonella)為一群生化反應(yīng)、抗原結(jié)構(gòu)相似的革蘭陰性桿菌，血清型別繁多，對(duì)人致病的有傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏沙門(mén)菌、希氏沙門(mén)菌、腸炎沙門(mén)菌，鼠傷寒沙門(mén)菌和豬霍亂沙門(mén)菌等，可引起人致傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥等疾病。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．傷寒沙門(mén)菌革蘭染色標(biāo)本片、鞭毛染色標(biāo)本片。
2．傷寒沙門(mén)菌，甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏沙門(mén)菌在普通瓊脂平板，中國(guó)藍(lán)平板，SS平板，伊紅美藍(lán)平板18~24h培養(yǎng)物。
【結(jié)果】
1．傷寒沙門(mén)菌為革蘭陰性桿菌，分散排列，鞭毛呈粗大、大波浪形。
2．菌落特征：傷寒、副傷寒沙門(mén)菌菌落特征一致(表10-3)。
表10-3 傷寒、副傷寒沙門(mén)菌在普通瓊脂平板、選擇鑒別培養(yǎng)基上的菌落特征
培 養(yǎng) 基菌 落 特 征
普通瓊脂平板 圓形，中等大小，灰白，半透明，邊緣整齊光滑
SS平板 較小，淡黃色，半透明
中國(guó)藍(lán)平板 較小，淡紅色半透明
伊紅美藍(lán)平板 較小，無(wú)色，半透明
（二) 生化反應(yīng)
【材料與方法】
1．取傷寒沙門(mén)菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏沙門(mén)菌分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。
2．取傷寒沙門(mén)菌，甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏沙門(mén)菌分別接種于雙糖鐵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。
3．吲哚試驗(yàn)、尿素分解試驗(yàn)見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四。
【結(jié)果】
生化反應(yīng)結(jié)果(表10-4)。
表10-4 傷寒、副傷寒桿菌主要生化反應(yīng)結(jié)果
細(xì)菌 葡 乳 麥 甘 蔗 動(dòng)力 H2S 吲哚 尿素
傷寒桿菌 + - + + - + + - -
甲型副傷寒桿菌 ⊕ - ⊕ ⊕ - + d - -
肖氏沙門(mén)菌 ⊕ - ⊕ ⊕ - + + 執(zhí)業(yè)藥師 - -
（三) 肥達(dá)(Widal)試驗(yàn)
【原理】
用已知的傷寒沙門(mén)菌O、H抗原和甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏沙門(mén)菌、希氏沙門(mén)菌H抗原的診斷菌液與待檢血清作定量凝集試驗(yàn)，以測(cè)定待檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體存在，作為傷寒、副傷寒診斷的參考，一般間隔5～7d重復(fù)采血檢查，如抗體效價(jià)隨病程進(jìn)展而上升，即有診斷價(jià)值。
【材料】
1．傷寒沙門(mén)菌O、H抗原菌液，甲型副傷寒沙門(mén)菌、肖氏沙門(mén)菌H抗原菌液，生理鹽水，待檢血清。
2．試管、1ml吸管、試管架、37℃水浴箱等。
【方法】
1．取清潔試管32支，分成4排，每排8支，依次編號(hào)(表10-5)。
2．于試管內(nèi)各加入生理鹽水0.5ml。
3．在每排第1管各加1∶10的待檢血清0.5ml，用1ml吸管吹吸數(shù)次，充分混勻，吸出0.5ml注入第1排第2管作對(duì)倍稀釋，依次稀釋至第7管，從第7管吸出0.5ml棄去，第8管為對(duì)照。同法將第2、3、4排依次作對(duì)倍稀釋。
表10-5 肥達(dá)氏反應(yīng)操作程序 (單位：ml)
管 號(hào)1 2 3 4 5 6 7 8
生理鹽水 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
1∶10待檢血清 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 棄去0.5
診斷抗原 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
血清稀釋度1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 -
結(jié) 果
4．從第8管開(kāi)始，從后向前，于第1排各管內(nèi)加入傷寒沙門(mén)菌H抗原菌液0.5ml；于第2排各管內(nèi)加入傷寒沙門(mén)菌O抗原菌液0.5ml；第3排各管分別加入甲型副傷寒沙門(mén)菌H抗原菌液0.5ml；第4排各管內(nèi)分別加入肖氏沙門(mén)菌H抗原菌液0.5ml。
5．加完菌液，振蕩試管架，混勻，置37℃水浴箱孵育16～18h后觀察結(jié)果。
【結(jié)果】
凝集程度，以“+”多少表示。
+ + + + 最強(qiáng)，上液澄清，細(xì)菌全部凝集于管底。
+ + + 強(qiáng)，上液輕度混濁，細(xì)菌大部分凝集于管底。
+ + 中強(qiáng)，上清半混濁，細(xì)菌部分凝集。
+ 弱，上液混濁，細(xì)菌少部分凝集。
- 不凝集，液體呈乳狀與對(duì)照管相同。
效價(jià)判定：對(duì)照管均不發(fā)生凝集時(shí)，依次觀察試驗(yàn)管。以使凝集呈“+ +”反應(yīng)的血清最高稀釋度為其凝集效價(jià)。
三、志賀菌屬
志賀菌屬(Shigella)是細(xì)菌性痢疾的病原菌，俗稱痢疾桿菌。細(xì)菌由消化道侵人腸道，靠侵襲力和毒素致病，毒素入血可引起毒血癥。
本菌屬的形態(tài)特點(diǎn)為革蘭陰性桿菌，無(wú)鞭毛，但菌體周?chē)芯�。除宋�?nèi)志賀菌個(gè)別菌株遲緩發(fā)酵乳糖外，均不分解乳糖。根據(jù)生化反應(yīng)及抗原不同可分為四群：A群(痢疾志賀菌)，B群(福氏志賀菌)，C群(鮑氏志賀菌)，D群(宋內(nèi)志賀菌)。目前，我國(guó)以福氏志賀菌最多見(jiàn)，宋內(nèi)志賀菌逐年增多，其他較少見(jiàn)。
（一)形態(tài)與培養(yǎng)特性
【材料與方法】
1．痢疾桿菌革蘭染色片。
2．痢疾桿菌普通瓊脂平板，中國(guó)藍(lán)平板，SS平板，EMB平板培養(yǎng)物。
【結(jié)果】
1．為革蘭陰性桿菌，分散排列。
2．菌落特征，同傷寒沙門(mén)菌。
注：宋內(nèi)志賀菌個(gè)別菌株可遲緩發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)2～10d，菌落特點(diǎn)可接近大腸桿菌菌落特點(diǎn)。
（二)生化反應(yīng)特性
【材料與方法】
1．葡萄糖、乳糖、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)。
2．雙糖鐵培養(yǎng)試驗(yàn)。
3．吲哚試驗(yàn)。
【結(jié)果】
生化反應(yīng)結(jié)果(表10-6)。
表10-6 痢疾桿菌糖發(fā)酵、雙糖鐵、吲哚試驗(yàn)結(jié)果
細(xì) 菌 葡 乳 麥 甘 蔗 動(dòng)力 H2S 吲哚
痢疾志賀菌 + - + - d - - d
福氏志賀菌 + - + + d - - d
宋內(nèi)志賀菌 + ﹡ + + + - - -
注: ﹡： 遲緩發(fā)酵；＋：產(chǎn)酸；－：不發(fā)酵；d：某些菌株陽(yáng)性
四、糞便標(biāo)本中致病性腸道桿菌的分離與鑒定
正常情況下腸道中有多種細(xì)菌寄生，包括大量的厭氧菌和大腸桿菌、變形桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌等。本實(shí)驗(yàn)的目的主要是分離沙門(mén)菌屬及志賀菌屬中的某些致病菌。
【標(biāo)本采集】
糞便中細(xì)菌極多，為此，糞便的微生物學(xué)檢查常根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康木牟煌x擇不同培養(yǎng)基或用適當(dāng)方法處理，盡可能地抑制雜菌，以利于病原菌的檢出。但并不是糞便標(biāo)本的采集無(wú)須注意雜菌污染。若便器或標(biāo)本盛器不潔而污染了變形桿菌，就可能影響病原菌的分離檢出，甚至把污染菌誤報(bào)造成誤診。
1．自然排便采集 自然排便后，挑取其膿血或粘液部分2～3g，液狀糞便取絮狀物2～3ml,置于滅菌容器內(nèi)送檢。
2．直腸拭子采集 如不易獲得糞便時(shí)，或排泄困難患者及嬰兒，可用直腸拭子采取。即用滅菌棉拭經(jīng)生理鹽水或甘油緩沖鹽水濕潤(rùn)后，插入肛門(mén)內(nèi)4～5cm(幼兒2～3cm)處，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)一圈拿出，插入滅菌試管內(nèi)送檢。
3．標(biāo)本如不能立即送檢，可將其保存于30％甘油緩沖鹽水或?qū)ｉT(mén)運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)。
【分離培養(yǎng)程序】
自糞便中分離培養(yǎng)細(xì)菌需連續(xù)4d進(jìn)行試驗(yàn)(圖10-1)。
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糞便或直腸拭子 分離培養(yǎng)(SS、MAC)
37℃、18～24h
可疑菌落
初步鑒定 (雙糖鐵/尿素培養(yǎng)基)
系列生化反應(yīng)
最終鑒定——
血清學(xué)鑒定
圖10-1 糞便標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢查程序
第1日：
取糞便標(biāo)本用SS平板作分區(qū)劃線接種，37℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落特征。
腸道致病菌不分解乳糖，所以在SS平板上生長(zhǎng)的菌落為無(wú)色透明的小菌落。如能產(chǎn)生H2S，則菌落中心呈黑色。大腸桿菌在SS平板上一般不生長(zhǎng)，但如糞便標(biāo)本接種得多，大腸桿菌量多所以仍有少數(shù)生長(zhǎng)。大腸桿菌能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，菌落呈紅色，或菌落中心顯紅色，很容易和致病菌區(qū)分。
第2日：
觀察SS平板上菌落，用接種針挑取可疑菌落分別接種于雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基中、尿素培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果。
第3日：
觀察半固體-雙糖鐵培養(yǎng)基結(jié)果。如果雙糖鐵培養(yǎng)基中乳糖不發(fā)酵，可能為腸道致病菌。根據(jù)葡萄糖發(fā)酵結(jié)果、運(yùn)動(dòng)力的有無(wú)等可初步判定為哪一類細(xì)菌。最后鑒定該菌尚需自雙糖鐵培養(yǎng)基上取材做以下試驗(yàn)。
1．革蘭染色。
2．接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖單糖發(fā)酵管，蛋白胨水及其他培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～24h。
3．選用已知抗血清作玻片凝集試驗(yàn)。
第4日：
表10-7 糞便中常見(jiàn)腸桿菌主要生化反應(yīng)簡(jiǎn)明鑒定表
雙 糖 鐵 葡 乳 麥 甘 蔗 吲 甲 V 枸 尿
櫞
上 下 硫 動(dòng) 萄 芽 露基 酸
化
層 層 氫 力 糖 糖 糖 醇 糖 哚 紅 P 鹽 素
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大 腸 桿 菌 ＋ ⊕ － ＋ ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ d ＋ ＋ － － －
產(chǎn) 氣 桿 菌 ＋ ⊕ － ＋ ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ ＋ － － ＋ ＋ －
普通變形桿菌 － ⊕ ＋ ＋ ⊕ － ＋ － ＋ ＋ ＋ － － ＋
傷 寒 沙門(mén)菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － － ＋ － － －
甲型副傷寒沙門(mén)菌 － ⊕ d ＋ ⊕ － ⊕ ⊕ － － ＋ － － －
肖 氏 沙門(mén)菌 － ⊕ ＋ ＋ ⊕ － ⊕ ⊕ － － ＋ － d －
希 氏 沙門(mén)菌 － ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ － － ＋ － ＋ －
痢 疾 志賀菌 － ＋ － － ＋ － ＋ － d d ＋ － － －
福 氏 志賀菌 － ＋ － － ＋ － ＋ ＋ d d ＋ － － －
鮑 氏 志賀菌 － ＋ － － ＋ － ＋ ＋ － d ＋ － － －
宋 內(nèi) 志賀菌 ﹡ ＋ － － ＋ ﹡ ＋ ＋ ＋ － ＋ － － －
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注：﹡：遲緩發(fā)酵；＋：產(chǎn)酸；⊕：產(chǎn)酸產(chǎn)氣；－：不發(fā)酵；d：某些菌株陽(yáng)性
1．觀察單糖發(fā)酵及其他培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果。
2．根據(jù)以上各試驗(yàn)結(jié)果，判定被檢糞便中分離的腸道致病菌是哪一種細(xì)菌(表10-7)。
附錄
1．SS瓊脂平板
沙門(mén)志賀菌屬瓊脂(salmonella Shigella agar，簡(jiǎn)稱SS agar)是一種用于沙門(mén)菌和志賀菌分離培養(yǎng)的選擇鑒別培養(yǎng)基。由于有膽鹽，能部分地抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，但能促進(jìn)沙門(mén)菌、志賀菌生長(zhǎng)的作用，有利于致病菌的分離。
成分：
蛋白胨5g
牛肉膏5g 基礎(chǔ)培養(yǎng)部分
瓊脂 18g
乳糖 10g 鑒別乳糖是否發(fā)酵
0.5%中性紅水溶液 4.5ml
膽 鹽 10g
枸櫞酸鈉 10～14g 抑制革蘭陽(yáng)性菌、大腸桿菌
0.1%煌綠水溶液 0.33ml
硫代硫酸鈉 8.5～10g
枸櫞酸鐵 0.5g 鑒別H2S的產(chǎn)生
蒸餾水 1000ml
作用：
由于此培養(yǎng)基能抑制部分大腸桿菌生長(zhǎng)，而對(duì)沙門(mén)菌和痢疾桿菌無(wú)影響，所以作分離培養(yǎng)時(shí)，標(biāo)本的接種量可以大一些，有利于致病菌的分離。在此培養(yǎng)基上沙門(mén)菌、痢疾桿菌不發(fā)酵乳糖，為無(wú)色的小菌落，而大腸桿菌能發(fā)酵乳糖呈紅色的菌落。
2．雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基
雙糖鐵—半固體培養(yǎng)基是一種復(fù)合性的檢查生化反應(yīng)的培養(yǎng)基，可檢查4種反應(yīng)即葡萄糖、乳糖的發(fā)酵反應(yīng)，是否產(chǎn)生H2S，有無(wú)動(dòng)力等(表10-8)。
成分：
下層： pH 7.6蛋白胨水 500ml
葡萄糖1g
瓊 脂1.75g
酚 紅 0.012g
斜面： pH 7.6蛋白胨水 500ml
硫代硫酸鈉0.1g
硫酸亞鐵銨0.1g
乳 糖5g
瓊 脂 6.5g
酚 紅 0.012g
表10-8 幾種腸道桿菌在雙糖鐵一半固體培養(yǎng)基中的反應(yīng)
| 胨 斜面 Fe2+ (固體) 乳糖 酚紅 | 被利用，產(chǎn)堿 +/－ － 變紅 | 被利用，產(chǎn)堿 － － 變紅 | 被利用產(chǎn)堿,但被酸中和 － ⊕ 變黃 |
| 胨 下層 葡萄糖 (半固體) 酚紅 動(dòng)力 | 被利用產(chǎn)堿,但被酸中和 +/⊕ 變黃 + | 被利用產(chǎn)堿,但被酸中和 + 變黃 － | 被利用產(chǎn)堿,但被酸中和 ⊕ 變黃 + |
| 初步 鑒定 | 可能是沙門(mén)菌 或變形桿菌 | 可能為志賀菌 | 不是沙門(mén)菌或志賀菌 |
| 進(jìn)一步 鑒定 | 尿素 吲哚 抗原鑒定 | 生化反應(yīng) 抗原鑒定 |
作用：
一般認(rèn)為沙門(mén)菌屬和志賀菌屬是主要的腸道致病菌。這兩屬細(xì)菌都能發(fā)酵葡萄糖，但一般不能發(fā)酵乳糖。與此相反，腸道條件致病菌中的大腸菌屬和克雷伯菌屬則能發(fā)酵乳糖，由此可見(jiàn)乳糖是否被利用是區(qū)別腸道致病菌和條件致病菌的關(guān)健�？衫秒p糖鐵—半固體培養(yǎng)基初步鑒別腸道致病菌與非致病菌。
