儀器分析-電子教材:第五章分子熒光分析法

第五章  分子熒光分析法

第一節(jié) 概述

物質(zhì)分子吸收外界能量后，其電子能級(jí)由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)分子以輻射的形式釋放能量回到基態(tài)，根據(jù)這一現(xiàn)象建立的分析方法稱為發(fā)光分析法。外界提供能量的方式有多種，若物質(zhì)吸收光能后的激發(fā)態(tài)以電磁輻射形式釋放能量回到基態(tài)，稱為光致發(fā)光。常見的光致發(fā)光有熒光（fluorescence)和磷光（phosphorescence)兩種。根據(jù)研究對(duì)象的不同，熒光可分為原子熒光和分子熒光。根據(jù)物質(zhì)的分子吸收光能后發(fā)射出熒光光譜的特征和強(qiáng)度對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析方法稱為分子熒光分析法（molecularfluorescence analysis)。熒光的波長范圍比較廣，可從X光到紅外光區(qū)。本章重點(diǎn)介紹紫外、可見光區(qū)域的分子熒光。

熒光分析法不僅能直接測定熒光物質(zhì)，也能通過衍生反應(yīng)測定非熒光物質(zhì)。熒光分析法靈敏度高，其檢測限可達(dá)10^-10~10^-12g/ml，靈敏度比紫外可見光譜法高2～4個(gè)數(shù)量級(jí)，且選擇性好，能提供諸多分析信息。已成為重要的痕量分析手段，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。

 第二節(jié) 基本原理

一、分子熒光的發(fā)生過程

物質(zhì)分子中存在著電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。在室溫時(shí)，大多數(shù)分子處于電子基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)（基態(tài))。當(dāng)分子吸收能量（電能、光能、熱能或化學(xué)能等)后，就會(huì)發(fā)生能級(jí)之間的躍遷�？绍S遷到激發(fā)態(tài)。分子在激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定的，它很快躍遷回到基態(tài)。

在基態(tài)分子中，電子按能量最低原則成對(duì)地排列于一定的軌道中。根據(jù)泡利（Pauli)不相容原理，分子內(nèi)同一軌道中的兩個(gè)電子必須具有相反的旋轉(zhuǎn)方向，即自旋量子數(shù)S分別為1/2和-1/2，總自旋量子數(shù)（的代數(shù)和)S_總 =0，其分子態(tài)的多重性M=2S+1=1，該分子就處在單重態(tài)（見圖5—1a)。倘若分子吸收能量后在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的改變，則分子處于激發(fā)單重態(tài)（見圖5—1b)。如果在躍遷到高能級(jí)的過程中伴隨著電子自旋方向的改變，這時(shí)，分子便具有兩個(gè)不配對(duì)的電子，則有S_總=1，M=2S+1=3，該分子處在激發(fā)三重態(tài)（見圖5—1c)，用符號(hào)T表示。處在分立的電子軌道的非成對(duì)電子，平行自旋比配對(duì)自旋更穩(wěn)定，因此，三重激發(fā)態(tài)的能級(jí)比相應(yīng)的單重激發(fā)態(tài)的能級(jí)要低。

圖5-1  單重態(tài)和三重態(tài)

當(dāng)分子吸收光能量后，處于基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)以至更高激發(fā)態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)(這一過程速度很快，大約10^-15s)，成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過輻射躍遷或無輻射躍遷釋放出能量返回基態(tài)，這一過程稱為去激發(fā)過程。

分子吸收光能量后去激發(fā)的光物理過程見圖5—2。

圖5-2熒光和磷光產(chǎn)生示意圖

圖中S₀，S₁，S₂分別表示分子的基態(tài)、第一和第二激發(fā)單重態(tài)，T₁表示第一激發(fā)三重態(tài)。激發(fā)態(tài)分子去激發(fā)過程中的幾種能量傳遞的方式有：①振動(dòng)弛豫：激發(fā)態(tài)（如S₁和S₂)的分子通過與溶劑分子的碰撞，把多余的振動(dòng)能量極迅速地（約為10^-12s)傳遞給周圍的分子，而自身返回該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)。②內(nèi)部轉(zhuǎn)換：當(dāng)S₁的較低振動(dòng)能級(jí)和S₂較高振動(dòng)能級(jí)的能量相當(dāng)或重疊時(shí)，分子有可能從S₂的振動(dòng)能級(jí)以無輻射方式過渡到S₁的振動(dòng)能量相等的振動(dòng)能級(jí)上，內(nèi)部轉(zhuǎn)換發(fā)生的時(shí)間為10^-12s。③熒光發(fā)射：處于第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子仍不穩(wěn)定，再以輻射形式發(fā)射光量子而返回基態(tài)的任意振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)發(fā)射的光量子稱為熒光。熒光發(fā)射過程約為10^-7~10^-9s左右。由于振動(dòng)馳豫和內(nèi)部轉(zhuǎn)換使激發(fā)態(tài)分子失去部分能量，因此熒光的波長總比激發(fā)光波長要長。④外轉(zhuǎn)換：激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子間相互作用，并以熱的形式損失部分能量的過程稱為外部轉(zhuǎn)換。外部轉(zhuǎn)換使熒光強(qiáng)度減弱或消失，導(dǎo)致熒光猝滅。⑤體系間跨越：在激發(fā)和去激發(fā)過程中，通常電子的旋轉(zhuǎn)狀態(tài)保持不變，但在某些狀態(tài)下，單重態(tài)通過體系間跨越，激發(fā)態(tài)電子改變其自旋方向出現(xiàn)三重態(tài)。當(dāng)兩種能態(tài)的振動(dòng)能級(jí)重疊時(shí)，這種躍遷的概率增大。⑥磷光發(fā)射：激發(fā)態(tài)分子經(jīng)體系間跨越到達(dá)激發(fā)三重態(tài)后，并經(jīng)過振動(dòng)馳豫到達(dá)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再回到基態(tài)各個(gè)振動(dòng)能級(jí)的過程中發(fā)射出磷光。磷光發(fā)射涉及到電子自旋狀態(tài)的改變，屬于“禁阻躍遷”，其壽命比熒光要長，約為10^-3~10 s，所以，將激發(fā)光從磷光樣品移走后，常常還可以觀察到后發(fā)光現(xiàn)象，而熒光發(fā)射卻觀察不到該現(xiàn)象。

二、激發(fā)光譜和熒光光譜

所有熒光化合物，都具有兩種特征光譜，即熒光激發(fā)光譜與熒光發(fā)射光譜。

(一) 熒光激發(fā)光譜 熒光激發(fā)光譜（excitation spectrum)簡稱激發(fā)光譜。固定熒光波長，改變激發(fā)光波長，測定不同波長的激發(fā)光激發(fā)所得到的熒光強(qiáng)度，然后以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，即為該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜(如圖5-3虛線部分)。激發(fā)光譜相當(dāng)于熒光物質(zhì)的吸收光譜，此光譜上熒光強(qiáng)度最大所對(duì)應(yīng)的波長，就是激發(fā)熒光最靈敏的波長。

（二)熒光發(fā)射光譜  熒光發(fā)射光譜  (fluorescencespectrum)簡稱熒光光譜。固定激發(fā)波長在物質(zhì)的激發(fā)熒光最靈敏的波長，測定不同熒光波長時(shí)的熒光強(qiáng)度F，以熒光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，即為熒光發(fā)射光譜， (如圖5-3實(shí)線部分)。此光譜上熒光強(qiáng)度最大的波長稱為最大熒光波長。

圖5-3蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜(環(huán)己烷作溶劑)

（三)三維熒光光譜 三維熒光光譜(Three dimensionalfluorescent spectroscopy )， 也稱總發(fā)光光譜、等高線光譜等。三維熒光光譜是20世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的一種新的熒光分析技術(shù)，主要是能獲得激發(fā)波長與發(fā)射波長同時(shí)變化的熒光強(qiáng)度光譜圖。三維熒光光譜可用兩種形式表示： （1)三維曲線光譜圖；（2)平面顯示的等強(qiáng)度線光譜圖, 如圖5-4(a)和(b)所示。三維熒光光譜技術(shù)能夠獲得完整的熒光光譜的信息，是一種很有價(jià)值的光譜指紋技術(shù)。可以進(jìn)行多組分混合物的定性、定量分析。

圖5-4 三維熒光光譜圖

（四)熒光光譜的特征

1．熒光光譜與激發(fā)光波長無關(guān)：從熒光發(fā)生過程可知，處于不同激發(fā)態(tài)分子的熒光發(fā)射，電子最終都是從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)開始，直接發(fā)射熒光而回到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)上，所以熒光光譜與激發(fā)光波長無關(guān)。

2．熒光波長比激發(fā)光波長較長  這是由于激發(fā)光以無輻射躍遷失掉一部分能量到達(dá)第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)，再發(fā)射熒光，因此熒光發(fā)射能量比激發(fā)能量低，故熒光波長比激發(fā)光譜的波長較長。這種現(xiàn)象稱為Stokes位移，又稱紅移。

3．激發(fā)光譜與熒光光譜呈現(xiàn)鏡像對(duì)稱關(guān)系  以蒽乙醇溶液為例，激發(fā)光譜中的小峰是蒽分子吸收能量后從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的各個(gè)不同的振動(dòng)能級(jí)所造成的。而發(fā)射光譜中的小峰是由于蒽分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，發(fā)射不同的光量子所產(chǎn)生。大多數(shù)分子的基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布和第一電子激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布相似，因此，激發(fā)光譜中躍遷能量最小的和最大的波長分別和熒光光譜中發(fā)射能量最大的和最小的相對(duì)應(yīng)，使激發(fā)光譜與熒光光譜相對(duì)稱并呈現(xiàn)鏡像關(guān)系。

（五)激發(fā)光譜與熒光光譜的應(yīng)用

1．定性分析  將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜圖的形狀、位置與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖進(jìn)行比較，即可進(jìn)行定性分析。由于有激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)譜圖可供參考，所以熒光光譜法定性的可靠性較紫外可見吸收光譜法高。

2．定量分析 根據(jù)熒光光譜圖中最大激發(fā)波長λ_ex和最大熒光波長λ_em，可以得到定量分析的最佳光譜條件

三、熒光與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

熒光的發(fā)生涉及分子吸收輻射和激發(fā)態(tài)分子發(fā)射輻射兩個(gè)過程，因此，能夠發(fā)熒光的物質(zhì)必須同時(shí)具備兩個(gè)條件，一是物質(zhì)分子必須具有強(qiáng)的吸收紫外-可兄輻射的征結(jié)構(gòu)；二是必須具有較高的的熒光效率。

（一)熒光發(fā)射的量子產(chǎn)率

物質(zhì)發(fā)射熒光的光子數(shù)和所吸收的激發(fā)光光子數(shù)的比值稱為熒光量子產(chǎn)率(fluorescence quantumyield)，或稱熒光效率 (fluorescence efficiency)，用  表示：

可見的極大值為1，但事實(shí)上大部分熒光物質(zhì)的值均小于1并在1和0之間。許多能吸收光能量的物質(zhì)不一定會(huì)發(fā)出熒光，因?yàn)樵诩ぐl(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能過程中除熒光發(fā)射外，有無輻射躍遷過程與之競爭。因此，熒光效率與熒光發(fā)射過程的速率及無輻射過程的速率有關(guān)，即：

  （5-1)

式中，為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)；無輻射躍遷過程的速率常數(shù)總和。主要取決于分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而與熒光物質(zhì)分子所處的化學(xué)環(huán)境有關(guān)，降低有利于體系的熒光增強(qiáng)。

（二)分子結(jié)構(gòu)與熒光

由于熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊性所致，在已知的大量有機(jī)物和無機(jī)物中，只有小部分可以產(chǎn)生熒光。熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)應(yīng)具備如下特征：

1．共軛π鍵結(jié)構(gòu) 絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)含有芳香環(huán)或雜環(huán)。因?yàn)檫@些分子具有共軛p鍵結(jié)構(gòu)，易發(fā)生π—π^*躍遷，分子體系共軛程度愈大，熒光效率愈高（表5-1)。另外含有共軛雙鍵的脂肪烴也可產(chǎn)生熒光，如維生素A，但這類化合物很少。

表5-1  三個(gè)化合物的共軛結(jié)構(gòu)與熒光效率的關(guān)系

2．剛性平面結(jié)構(gòu)  具有剛性平面構(gòu)型的分子有利于熒光發(fā)射， 由于這種剛性平面構(gòu)型降低了分子的振動(dòng)，減少了分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用，提高了分子的熒光效率。例如熒光素呈平面構(gòu)型，是強(qiáng)熒光物質(zhì)，它在0.1mol/L NaOH溶液中的熒光效率為0.92，而與其結(jié)構(gòu)相似的酚酞由于沒有氧橋，分子不易保持平面，所以分子不發(fā)光，不是熒光物質(zhì)。

3. 取代基團(tuán)對(duì)分子熒光的影響  在芳香族化合物的芳香環(huán)上取代基不同，對(duì)熒光物質(zhì)的熒光光譜和熒光強(qiáng)度都有很大影響。給電子取代基，如：-NH₂、-OH、-OCH₃、-CN等，能增加分子的π電子共軛程度，使熒光效率提高；而吸電子基團(tuán)，如：-COOH、-NO₂、-C＝O、-F、-C1等，可減弱分子π電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。

四、熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系

分子熒光分析法是測定物質(zhì)吸收一定光能被激發(fā)之后，物質(zhì)本身所發(fā)射的熒光強(qiáng)度（F)。因此，被測溶液的熒光強(qiáng)度與該溶液吸收光能的強(qiáng)度以及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。當(dāng)強(qiáng)度為I₀的入射光激發(fā)熒光物質(zhì)溶液后，可以從溶液的各個(gè)方向觀察到熒光，但激發(fā)光的一部分可透過溶液，為了消除透射光的影響，一般是在與激發(fā)光源垂直的方向觀測。如圖5-5所示

圖5-5  溶液的熒光

假設(shè)強(qiáng)度為I₀的入射光，照射到濃度為c，液層厚度為b的熒光物質(zhì)溶液上，透射光強(qiáng)度為I，被溶液吸收光強(qiáng)度為I₀ -I，溶液的熒光效率為，熒光強(qiáng)度為F。根據(jù)光吸收定律

  （5-2)

則     

（5-3)

由于溶液的熒光強(qiáng)度F與被溶液吸收的光強(qiáng)度及熒光效率成正比

則      

 （5-4)

式中k為比例常數(shù)

因  

  （5-5)

則 

    （5-6)

如果濃度c很小，當(dāng)時(shí)，中括號(hào)內(nèi)第二項(xiàng)以后的數(shù)值可以忽略不計(jì)，上式可寫成

（5-7)

對(duì)一定的熒光物質(zhì)，當(dāng)測定條件固定時(shí)，則

   （5-8)

對(duì)某一物質(zhì)的稀溶液()，在一定的條件下，物質(zhì)發(fā)出的熒光強(qiáng)度與該溶液的濃度成正比。即為分子熒光分析法的定量依據(jù)。

五、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

（一) 溶劑的影響  

在不同的溶劑中，同一種熒光物質(zhì)，其熒光光譜的位置和熒光強(qiáng)度都有一定差異。溶劑的影響主要與溶劑的極性、粘度、純度有關(guān)。

1．熒光強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)可隨溶劑粘度的減小而減小。因?yàn)槿軇┱扯葴p小時(shí)增加了分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無輻射躍遷增加，造成能量損失，熒光強(qiáng)度減弱。

2．溶劑和熒光物質(zhì)形成化合物，溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，使熒光峰的波長和熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。如在萘胺的乙醇溶液中加入鹽酸，隨著溶液中鹽酸濃度的增加，萘胺的—NH₂基逐漸被—NH₃Cl基所代替，而—NH₃Cl基對(duì)萘環(huán)的特征頻率的影響小于—NH₂，因此溶液的熒光光譜趨近于萘的熒光光譜。

3．熒光波長隨溶劑極性增大而紅移。許多共軛芳香族化合物激發(fā)時(shí)產(chǎn)生π—π^*躍遷，其激發(fā)態(tài)比基態(tài)具有更大的極性，隨著溶劑極性的增大，激發(fā)態(tài)能量的降低程度比基態(tài)大，結(jié)果使熒光光譜隨溶劑的極性增大而向長波方向移動(dòng)。

4．溶劑的純度要高。雜質(zhì)會(huì)使被測物的熒光增強(qiáng)或減弱，甚至改變熒光光譜的形狀，最終干擾樣品的測定。如用乙醇作溶劑時(shí)，若含有微量蒽，會(huì)使溶劑本身產(chǎn)生熒光。特別是當(dāng)溶劑中存在降低熒光強(qiáng)度的物質(zhì)時(shí)，常常因不易被發(fā)覺而引入測定誤差。因此在使用前應(yīng)設(shè)法純化溶劑，消除干擾。

(二) 溫度的影響

溶液的熒光強(qiáng)度對(duì)溫度十分敏感，一般情況下隨著溫度的升高，熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度減小。其主要原因是溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾率增加，增加了分子的無輻射躍遷，降低了熒光效率。另外，有些熒光物質(zhì)在較高溫度下會(huì)發(fā)生光分解，導(dǎo)致熒光效率降低。降低溫度有利于提高熒光效率，因此，低溫?zé)晒夥治黾夹g(shù)已成為熒光分析的一個(gè)重要手段。

(三) 酸度的影響

酸度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響主要表現(xiàn)在下列兩個(gè)方面：

1．影響熒光物質(zhì)的存在形式 熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，在不同酸度條件下分子和離子間的平衡發(fā)生改變，造成存在形式不同，而不同的結(jié)構(gòu)型體具有其特定的熒光光譜和熒光效率。例如苯胺，分子和離子間的平衡如下

苯胺在pH7～12的溶液中主要以分子形式存在，—NH₂為提高熒光效率的取代基，此時(shí)苯胺可產(chǎn)生藍(lán)色熒光，而pH＜2 和pH＞13的溶液中苯胺為離子形式，無熒光產(chǎn)生。

2．影響熒光配合物的組成 當(dāng)利用金屬離子與有機(jī)試劑生成熒光配合物進(jìn)行測定時(shí)，其配合物的穩(wěn)定性和組成受溶液pH值的影響較大，例如Ga²⁺與2，2-二羥基偶氮苯在pH為3~4的溶液中形成1：1配合物，產(chǎn)生熒光。而在pH6～7的溶液中則形成1：2的配合物，不產(chǎn)生熒光。

可見，熒光物質(zhì)的熒光光譜、熒光效率及熒光強(qiáng)度隨溶液pH值的變化而變化，為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度，在實(shí)驗(yàn)時(shí)要嚴(yán)格控制溶液的pH值。

(四) 熒光猝滅

熒光物質(zhì)分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度下降，或熒光強(qiáng)度與溶液濃度不成線性關(guān)系的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。與熒光物質(zhì)分子發(fā)生相互作用引起熒光猝滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。常見的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物等。引起熒光猝滅的原因有：

1．碰撞猝滅  激發(fā)態(tài)熒光物質(zhì)和猝滅劑分子碰撞使能量發(fā)生轉(zhuǎn)移。熒光分子以無輻射躍遷的方式回到基態(tài)，產(chǎn)生猝滅作用。

2．靜態(tài)猝滅  熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子作用生成了不發(fā)光的配合物。

3．轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅  熒光物質(zhì)分子中引入溴、碘或氧后，易發(fā)生體系間跨越，醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)由單重態(tài)躍遷到三重態(tài)，而無熒光發(fā)射，引起猝滅。

4．熒光物質(zhì)的自猝滅  當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較高時(shí)由于熒光分子間碰撞幾率增加，以及分子間相互作用形成二聚體或多聚體，產(chǎn)生熒光自猝滅現(xiàn)象。溶液濃度越高，自猝滅現(xiàn)象越嚴(yán)重。

5．內(nèi)濾作用  當(dāng)溶液中存在能吸收熒光物質(zhì)的激發(fā)光或發(fā)射光的物質(zhì)時(shí)，也會(huì)使體系的熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)濾作用。如果熒光物質(zhì)的熒光光譜與該物質(zhì)的吸收光譜有重疊，當(dāng)濃度較大時(shí)，部分基態(tài)分子將吸收體系發(fā)射的熒光，從而使熒光強(qiáng)度降低，這種自吸現(xiàn)象也是一種內(nèi)濾作用。

熒光猝滅影響熒光測定，這是熒光分析中的不利因素，但是如果一個(gè)熒光物質(zhì)在加入某種猝滅劑后，熒光強(qiáng)度減小的程度和熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，如利用氧分子對(duì)硼酸根－二苯乙醇酮配合物的熒光猝滅效應(yīng)可以進(jìn)行微量氧的測定。鋁—桑色素配合物的熒光強(qiáng)度因微量氟離子的存在而引起熒光猝滅，可用于測定樣品中氟離子的含量。利用這一性質(zhì)建立猝滅劑的熒光測定法，稱為熒光猝滅法(fluorescencequenching method)。熒光猝滅法比直接熒光法更靈敏、更有選擇性。

(五) 散射光

在熒光分析中，干擾熒光測定的散射光主要有三種。

1．瑞利(Reyleigh)散射  物質(zhì)分子吸收光能后，不足以引起電子能級(jí)的躍遷，而是將分子激發(fā)到基態(tài)中較高的振動(dòng)能級(jí)，并在極短的時(shí)間內(nèi)回到原來能級(jí)，所發(fā)射的光稱為瑞利散射光。由于它沒有能量損失，所以瑞利散射光和激發(fā)光的波長相同，且它的強(qiáng)度與波長的四次方成反比，即波長越短，瑞利散射越大。瑞利散射主要是由溶劑和其它共存物質(zhì)分子產(chǎn)生。

2．拉曼(Raman)散射  由于物質(zhì)分子吸收了光能后，被激發(fā)到基態(tài)的較高振動(dòng)能級(jí)以后，返回到稍高于或稍低于原來的能級(jí)而發(fā)出的光稱拉曼散射光。其波長比它的激發(fā)光波長稍長或稍短。拉曼散射光較弱，且它的波長隨激發(fā)光的波長不同而改變。

3．丁鐸爾(Tyndall)散射  樣品池中如有膠體顆�；驓馀荽嬖跁r(shí)，入射光就會(huì)改變方向而進(jìn)入檢測器，這種現(xiàn)象稱為丁鐸爾散射。它的波長和激發(fā)光的波長一致，因此容易辨認(rèn)，當(dāng)樣品溶液除去膠粒和氣泡后，丁鐸爾散射即可消除。

散射光對(duì)熒光測定有干擾，尤其是波長比入射光波長更長的拉曼光，對(duì)熒光的測定干擾更大，必須采取措施消除。

瑞利散射光波長與激發(fā)光波長相同，只要選擇適當(dāng)?shù)牟ㄩL即可將其消除。拉曼散射光波長與激發(fā)光波長有差值，并且隨激發(fā)光波長改變而改變，而熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長無關(guān)，即可通過選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長把物質(zhì)的熒光與溶劑拉曼散射光區(qū)別開來。有時(shí)溶劑的拉曼光譜與物質(zhì)的熒光光譜相重疊影響熒光測量，故激發(fā)光的選擇一方面要考慮較高的靈敏度，另一方面要使溶劑的拉曼散射光與熒光峰相距遠(yuǎn)些，以避免干擾。

表5—2為水、乙醇、環(huán)己烷等常用溶劑在不同波長激發(fā)光照射下拉曼光的波長�？晒┻x擇激發(fā)光波長或溶劑時(shí)參考。

表5-2  在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長（nm)

第三節(jié) 熒光分析儀器

一、儀器的主要部件

測量熒光強(qiáng)度的儀器有熒光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)。前者結(jié)構(gòu)簡單，價(jià)格便宜；后者構(gòu)造精細(xì)，不僅定量測定的靈敏度和選擇性高，還可用于熒光物質(zhì)的定性鑒定。盡管儀器的類型不同，但其基本部件均包括下列五個(gè)部分：①激發(fā)光源；②單色器；③樣品池；④檢測器；⑤放大指示器。圖5-7是熒光計(jì)示意圖。

圖5-6 熒光計(jì)的示意圖

由光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分光后，照射到樣品溶液上，在波長λ_ex的紫外可見光激發(fā)下，樣品發(fā)出熒光。為了防止激發(fā)光的干擾，在與激發(fā)光垂直的位置上檢測樣品的熒光。樣品發(fā)出的熒光通過發(fā)射單色器分光后照到檢測器上，檢測器得到相應(yīng)于各種熒光波長λ_em時(shí)的熒光強(qiáng)度F。

1．激發(fā)光源  理想的光源應(yīng)能發(fā)射含有各種波長的紫外光和可見光，光的強(qiáng)度不僅足夠大，并且在整個(gè)波段范圍內(nèi)強(qiáng)度一致，但是理想的光源不易得到，通常用高壓汞燈、鹵鎢燈和氙燈。高壓汞燈產(chǎn)生強(qiáng)烈的線光譜。濾光片熒光光度計(jì)的光源大都用汞燈或鹵鎢燈(碘鎢燈或溴鎢燈300nm～700nm)作光源。

高壓氙燈是一種短弧氣體放電燈，是熒光分光光度計(jì)應(yīng)用最廣的光源。燈內(nèi)裝有氙氣，通電后氙氣電離，同時(shí)產(chǎn)生較強(qiáng)的連續(xù)光譜，波長在250nm～700nm之間，而且在整個(gè)波段內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度幾乎相等。由于氙燈的啟動(dòng)電壓約20kV－40kV，所以當(dāng)儀器配有計(jì)算機(jī)時(shí)，應(yīng)使氙燈點(diǎn)著穩(wěn)定后再開計(jì)算機(jī)．

以激光為光源的熒光分析法，可極大地提高熒光分析的靈敏度，目前激光誘導(dǎo)熒光光譜分析已達(dá)到單個(gè)分子檢測水平。

2．單色器  測定熒光的儀器需有兩個(gè)單色器，第一單色器在光源與樣品池之間，稱激發(fā)單色器，其作用是讓所選擇的激發(fā)光透過照射在被測物質(zhì)上。第二單色器在樣品池和檢測器之間，與激發(fā)光源成90度角，稱為熒光單色器，它可以把容器的反射光、溶劑的散射光以及溶液中雜質(zhì)所產(chǎn)生的熒光除去，只讓特征波長的熒光通過而照射于檢測器上。

熒光光度計(jì)采用濾光片作單色器，分光能力較差，不能進(jìn)行激發(fā)光譜與熒光光譜的掃描。濾光片有三種: ①截止濾光片，用于截止雜散光或不需要波長的光，為發(fā)射單色器；②帶通濾光片，實(shí)際上有兩個(gè)截止濾色片組成,允許通過某一波長的光并有一定的譜帶寬度,透光率比截止濾色片差, 為激發(fā)單色器；③干涉濾光片，由兩個(gè)玻璃板之間附著兩層或多層金屬膜制成。每一層膜用一個(gè)無吸收物質(zhì)作隔膜與下一層金屬膜分開。金屬膜之間的距離決定了透過光的波長。使用干涉濾色片能得到較窄的帶寬和較高的透過率。

熒光分光光度計(jì)用光柵作單色器，光柵的分光能力強(qiáng)，且色散是線性的，便于進(jìn)行光譜掃描。但是色散后的光線有級(jí)數(shù)，須加前置濾光片加以消除。

3．樣品池  熒光測定用的樣品池一般用石英制成，因?yàn)椴Ａ��?huì)吸收320nm以下的紫外光。樣品池的形狀以散射光較少的方形為宜。低溫?zé)晒鉁y定時(shí)可在石英池外套上一個(gè)盛放液氮的石英真空瓶，來降低溫度。

4．檢測器  用紫外可見光為激發(fā)光源時(shí)產(chǎn)生的熒光多為可見熒光，強(qiáng)度較弱，因此要求檢測器的靈敏度較高，通常采用光電倍增管。目前，光電二極管陣列式檢測器也已用于熒光分光光度計(jì)。

5．放大指示器  電信號(hào)經(jīng)放大器放大后可由表頭指示或數(shù)字顯示熒光強(qiáng)度，由記錄儀記錄結(jié)果。

二、儀器的類型

熒光儀器主要有熒光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)兩類。

（一)熒光光度計(jì)  用溴鎢燈或汞燈作光源，單色器為濾光片，通過第一濾光片可獲得一定通帶寬度的激發(fā)單色光，通過第二濾光片可得到所需要波長范圍的熒光。該類儀器一般用光電管為檢測器，電信號(hào)經(jīng)放大后用微安表指示出來。結(jié)構(gòu)簡單，價(jià)格較便宜，但只適用于物質(zhì)的定量分析。

另一種比較高級(jí)的熒光光度計(jì)是第一單色器用濾光片，第二單色器用棱鏡分光，這樣的儀器雖然不能得到激發(fā)光譜，但可得到熒光發(fā)射光譜，而且定量分析的靈敏度、選擇性得到提高。

（二)熒光分光光度計(jì)  熒光分光光度計(jì)采用氙燈作光源，通過狹縫經(jīng)光柵分光后照射到被測物質(zhì)上，發(fā)射的熒光經(jīng)第二單色器分后，用光電倍增管檢測熒光強(qiáng)度，經(jīng)放大器放大后由記錄儀記錄結(jié)果。它不僅定量分析的靈敏度高和選擇性好，而且可以掃描繪出物質(zhì)的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜，進(jìn)行定性分析。

第四節(jié) 熒光分析方法和應(yīng)用

—、定性分析

熒光物質(zhì)的特征光譜有激發(fā)光譜和熒光光譜兩種，而紫外可見分光光度法中，只能得到被測物質(zhì)的一種特征吸收光譜，因此，用熒光分析法做物質(zhì)鑒定時(shí)可靠性更強(qiáng)。定性方法是將其特征光譜的形狀、波長范圍與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，從而確定待測物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是否為同一物質(zhì)。

例如，大氣煙塵中苯并(a)芘的測定。樣品分離純化后，在熒光分光光度計(jì)上固定激發(fā)波長在386nm，第二單色器掃描，獲得樣品的熒光光譜。然后固定熒光波長在407nm，第一單單色器掃描，獲得樣品的激發(fā)光譜。如果確系苯并(a)芘，則測得的熒光光譜、激發(fā)光譜應(yīng)和苯并(a)芘標(biāo)準(zhǔn)品的光譜完全一致。

二、定量分析

熒光分析法更多用于熒光物質(zhì)的定量分析，根據(jù)熒光強(qiáng)度與該溶液的濃度成正比的定量關(guān)系，在一定的濃度的范圍內(nèi)，可以采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和直接比較法進(jìn)行定量。

（一)標(biāo)準(zhǔn)曲線法

取已知量的標(biāo)準(zhǔn)被測物質(zhì)，用與樣品相同的方法處理，配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次測量其熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測出樣品溶液的熒光強(qiáng)度，即可由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品中熒光物質(zhì)的含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線在應(yīng)用過程中要不斷進(jìn)行校正。如果該溶液在紫外光照射下不夠穩(wěn)定，則需改用另一種穩(wěn)定而且熒光峰相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行校正。例如測定維生素B₁時(shí)，用硫酸奎寧為基準(zhǔn)；測定維生素B₂時(shí)，用熒光素鈉作為基準(zhǔn)。

（二)直接比較法

要求待測物和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度必須在線性范圍之內(nèi)。測定時(shí)，配制一已知濃度的被測物標(biāo)準(zhǔn)溶液，與樣品用相同方法處理后，測定得標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的熒光強(qiáng)度分別F_s和F_x，求得樣品中熒光物質(zhì)含量。若空白溶液的熒光強(qiáng)度為F₀，則

（5-9)

  （5-10)

在同一條件下k為常數(shù)，則有

   （5-11)

三、熒光分析法的應(yīng)用

熒光分析可以利用直接熒光分析和間接熒光分析測定許多類有機(jī)化合物和無機(jī)物。對(duì)于自身能夠發(fā)出熒光的物質(zhì)可用直接熒光法測定。對(duì)于許多不發(fā)熒光或熒光效率很小的有機(jī)物和無機(jī)物，則通過化學(xué)反應(yīng)將其轉(zhuǎn)變成熒光物質(zhì)后進(jìn)行間接測定。因此，熒光分析廣泛應(yīng)用于衛(wèi)生檢驗(yàn)、臨床檢驗(yàn)、生物化學(xué)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。

（一)有機(jī)化合物的熒光分析

芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物在紫外光照射下大多數(shù)能發(fā)熒光。多環(huán)芳烴普遍存在于大氣、水、土壤、動(dòng)植物及加工食品中，目前已知有200多種具致癌性的多環(huán)芳烴，苯并(a)芘是致癌活性最強(qiáng)的一種，通過萃取或色譜分離后

進(jìn)行熒光測定，方法可靠，測定最低濃度可達(dá)0.1mg/L。

食品中維生素含量的測定是食品分析的常規(guī)項(xiàng)目。幾乎所有種類的維生素都可以用熒光法進(jìn)行分析。氨基酸、蛋白質(zhì)的熒光分析也都是很靈敏的常用方法。

對(duì)于某些弱熒光性物質(zhì)甚至不發(fā)熒光的物質(zhì)，如甾族化合物，經(jīng)濃H₂SO₄處理后，可使不產(chǎn)生熒光的環(huán)狀醇類結(jié)構(gòu)，改變?yōu)楫a(chǎn)生熒光的酚類結(jié)構(gòu)。幾種用于有機(jī)化合物的熒光試劑見表5-3。

表5-3  用于有機(jī)化合物測定的熒光試劑

(二) 無機(jī)元素的熒光分析

能產(chǎn)生熒光的無機(jī)物僅有鈾鹽等少數(shù)幾種，但許多金屬或非金屬離子可以和有機(jī)化合物形成熒光配合物,從而進(jìn)行熒光分析。目前利用該法可進(jìn)行熒光分析的無機(jī)元素已近70種。常見的幾種熒光測定試劑見表5-4。

表5-4 幾種熒光測定試劑

（三)基因研究及其檢驗(yàn)

遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA)，自身的熒光效率很低，一般條件下幾乎檢測不到DNA的熒光。因此，通常選用某些熒光分子作為探針，通過探針標(biāo)記分子的熒光變化來研究DNA與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計(jì)新的高效低毒藥物。目前，典型的熒光分子探針為溴乙啶（ED)。此外也使用Tb³⁺、吖啶類染料、鈣的配合物等。在基因檢測方面，已逐步使用熒光染料作為標(biāo)記物，來代替同位素標(biāo)記，從而克服了同位素標(biāo)記帶來的污染、價(jià)格昂貴及難保存等不足。

（四)時(shí)間分辨熒光免疫分析

近年來，時(shí)間分辨熒光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)作為一種新型的非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，其應(yīng)用不再局限于臨床診斷，現(xiàn)已滲透入生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

在通常的熒光測定中，主要討論熒光強(qiáng)度和熒光波長的熒光光譜圖的信息應(yīng)用，由于測試樣品中含有多種熒光成分，背景干擾強(qiáng)，因此成了熒光分析法大范圍推廣使用的瓶頸。然而熒光在發(fā)射過程中還有壽命信息，TRFIA巧妙地利用了熒光強(qiáng)度和時(shí)間的變化的關(guān)系及熒光壽命差別的信息，除了能測定熒光物質(zhì)的熒光壽命外，還可以消除干擾物和背景熒光的干擾，以及熒光混合物中多組分含量分析。當(dāng)混合物中多組分的熒光壽命差超過4ns時(shí)，便可進(jìn)行多組分同時(shí)測定。

TRFIA具有靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染、多標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)已成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗(yàn)中一項(xiàng)最有發(fā)展前景的分析手段。

第五節(jié) 磷光分析法簡介

分子磷光分析法與分子熒光分析在原理、儀器和應(yīng)用等方面非常相似，與熒光相比，磷光具有如下三個(gè)特點(diǎn)：①磷光輻射的波長比熒光長，這是因?yàn)榉肿拥腡_l態(tài)能量比S₁態(tài)低；②磷光的壽命比熒光長。由于熒光是S₁—S₀輻射躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷是自旋許可的躍遷，因而S₁態(tài)的輻射壽命通常在10^-7～10^-9s；磷光是T₁—S₀躍遷產(chǎn)生的，這種躍遷屬自旋禁阻的躍遷，其速率常數(shù)要小得多，因而輻射壽命要長，大約為10^-4～10s；③磷光的壽命和輻射強(qiáng)度受重原子和順磁性離子存在的影響極其敏感，使磷光增強(qiáng)，熒光則相反。

一、低溫磷光

由于激發(fā)三重態(tài)的壽命長，這使三重態(tài)去激發(fā)過程中的無輻射躍遷，如分子內(nèi)部轉(zhuǎn)化、激發(fā)態(tài)分子與周圍的溶劑分子間發(fā)生碰撞和而能量轉(zhuǎn)移以及發(fā)生某些光化學(xué)反應(yīng)等的概率增大，使磷光強(qiáng)度減弱，甚至完全消失。為減少這些去激發(fā)過程的影響，通常應(yīng)在低溫下測量磷光，以減少無幅射躍遷對(duì)磷光發(fā)射的影響。

低溫磷光分析中，液氮是最常用的冷卻劑。因此要求所使用的溶劑，在液氮溫度(77K)下對(duì)所分析的試樣應(yīng)具有良好的溶解特性，本身又容易制備和提純，并在所研究的光譜區(qū)域內(nèi)沒有很強(qiáng)的吸收和發(fā)射。最常用的溶劑是EPA，它由乙醇、異戊烷和二乙醚按體積比為2：5：5混合而成。使用含有重原子的混合溶劑IEPA(由EPA：碘甲烷＝10：1組成)，有利于系間跨越躍遷，可以增加磷光效應(yīng)。

二、室溫磷光

由于低溫磷光需要低溫實(shí)驗(yàn)裝置，并且溶劑選擇以及應(yīng)用范圍受到一定的限制。所以目前發(fā)展了多種室溫磷光法(RTP)。有固體基質(zhì)室溫磷光法(SS-RTP) ；膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法(MS-RTP) 執(zhí)業(yè)護(hù)士網(wǎng)；敏化溶液室溫磷光法(SS—RTP)。

膠束增穩(wěn)的溶液室溫磷光法(MS-RTP)當(dāng)溶液中表面活性劑的濃度達(dá)到臨界膠束濃度后，便相互聚集形成膠束。由于這種膠束的多相性，改變了磷光團(tuán)的微環(huán)境和定向的約束力，從而強(qiáng)烈影響了磷光團(tuán)的物理性質(zhì)，減小了內(nèi)轉(zhuǎn)化和碰撞能量損失等非輻射去激發(fā)過程的趨勢，明顯增加了三重態(tài)的穩(wěn)定性，從而可以實(shí)現(xiàn)在溶液中測量室溫磷光。利用膠束穩(wěn)定的因素、結(jié)合重原子效應(yīng)和溶液除氧，是MS-RTP的三個(gè)要素。

三、磷光分析法應(yīng)用

磷光分析在無機(jī)化合物測定中應(yīng)用較少，主要用于藥物分析、環(huán)境分析等等領(lǐng)域的有機(jī)樣品。一些有機(jī)化合物的磷光分析見表5—5。

表5-5  一些有機(jī)化合物的磷光分析^*

*WM 為水甲醇溶液；DL為檢出限（g/ml)

  (李珊，康維鈞)