醫(yī)學蜱螨學實驗指導
實驗一 蜱標本的采集、制作與保存
【實驗目的】
掌握蜱標本的采集、制作與保存基本實驗技術。
【實驗原理】
將蜱從其宿主體表或其洞（巢)穴和宿主自然孳生地捕捉獲得后，對所采集標本進行收集，用生理鹽水或人氏液清洗，用物理或化學方法固定，用脫水劑將標本脫水，以利于透明組織和保存玻片標本，最后進行標本封固以保存，使標本留存下來易于觀察。
【實驗材料】
1. 標本采集所需實驗材料：采集旗、采集瓶、標簽
2．標本制作所需實驗材料：解剖鏡、微型剪刀、平皿、5％KOH、系列酒精、冬青油、中性樹膠、生理鹽水
3．標本保存所需實驗材料：65%～75%乙醇、磨砂瓶、標簽
【實驗方法】
1．采集
（1)拖旗法采蜱
用白色結實棉布或法蘭絨，做成90cm×60cm旗子，一邊固定在100cm～120cm竹竿上，竹竿兩端栓上尼龍繩。拖旗法適用于林中或山間平坦處、河邊漫灘、低矮或不長荊棘的草地。采集時將旗子平鋪地面，拖拉繩子前進，每步行10～20步即可停下檢查有無蜱類。
（2)搖旗法采蜱
搖旗法適用于密林地區(qū)，植被高度過膝，樹木交錯，枝杈橫生，難能拖旗，可改為揮動旗幟的方法采集蜱類。
當發(fā)現(xiàn)有蜱，立即放入內，加塞，貼標簽，供鑒定、飼養(yǎng)、檢出、統(tǒng)計。如需調查密度，則在樣地均勻地拖旗或揮旗，以每人每小時或每人每100m所捕獲的蜱數(shù)統(tǒng)計，通常每一樣地不少于30min或500m。
（3)從宿主采蜱
1)家畜：如牛、羊、狗、馬、驢、駱駝、雞等。
2)野生動物：如鼠類、鳥類、野兔、野雞等。
3)人體：多侵襲頭發(fā)、頸項、耳朵、腋下、多毛、易汗?jié)瘛⒍喟欛薏课弧?/p>
（4)動物棲息地采蜱
畜舍、圈欄、狗房、雞窩、鳥巢、洞穴等。
（5)誘捕法采蜱
必要時，特意放出偵察犬或其它訓養(yǎng)動物也可誘捕蜱類。
2．標本制作
（1)大體標本制作：成蟲經(jīng)過5％KOH浸泡。一般活蜱可直接浸入上液中，其體內的血液沒有多大關系。但已固定的蜱，以體內沒有血者為佳�？捎眉氠樤隍珞w兩側無關緊要處扎數(shù)小孔，再用小平鏟輕壓蜱體，使被融解的內臟組織排出體外。用蒸餾水洗數(shù)次，每次半個小時左右。經(jīng)酒精系列脫水，每液2h左右，冬青油透明，當見到冬青油中蟲體透明即可用中性膠封片，以防時間過久蜱變脆易折斷。
對于硬蜱，整體玻片標本適合教學用，不宜為分類鑒定之用。因為蜱體一經(jīng)透明就失去鑒別的特征。而軟蜱在分類鑒定時，可制成局部標本，即將蟲體局部的背腹側剪成三角形，或將背腹面分開，直接用膠封片。
（2) 內部構造標本制片 當活成蟲體內血液消化時，用微型剪刀將蜱身體周緣剪開，再放入盛有生理鹽水的小玻皿中，置于解剖鏡下解剖。小心的將外皮去掉，留其內臟組織，如消化、生殖系統(tǒng)，按照昆蟲的軟組織制片法，進行固定、染色、脫水和封片。
3．蜱標本保存
（1)死蜱標本的保存技術
常用的方法是浸泡法，如酒精浸泡等。將捕獲的蜱類用70~80℃的熱水殺死，取出后稍干泡在65~75%酒精中長期保存或送交專門部門。酒精容量要比標本多4~5倍，使蜱類標本能固定在展肢狀態(tài)。注意要標明標本來源、生境、宿主、時間和采集者等信息。有時為了進行DNA或RNA檢測分析技術，這就需要采用DNAlater或RNAlater等溶液作專門處理。
（2)活蜱標本的保存技術
常采用的蜱盒和試管保存方法，可將洗凈消毒容器，放入消毒處理的細沙上面覆蓋棉花，再覆蓋濾紙片。然后放入反復摺皺的濾紙條（事先蘸有防霉劑如新霉素、氯霉素等)，接入活蜱可使蜱上下活動。容器口用棉塞或絹紗封閉。注意保持容器內的濕度，可每隔3~5天向沙子滴加無菌水，保持濕度在85%~95%、溫度在15~22℃之間為宜。
【實驗結果】
采集到蜱標本，成功進行標本制作與保存。
【注意事項】
1. 蟲體在固定之前應清洗時應避免對蟲體的形態(tài)和結構造成損傷。
2. 標本脫水時，應用系列酒精使標本從低濃度到高濃度逐步脫水。
3. 為防止脫水劑揮發(fā)或吸水等外界影響，脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進行。
4. 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象，必要時候可重復脫水。
5. 固定劑新鮮配制使用為宜，如需保存應避光、陰涼保存。
6. 封固時蓋玻片的大小以其周圍留有約為2 mm左右距離為宜。若太靠近在載片邊緣，則易使染色標本受空氣中酸的作用而褪色。
7. 封固劑的用量應根據(jù)標本的大小和蓋玻片的大小決定。若封固液不足應從蓋玻片邊緣補足；若滴加過多時，待封片干后，將外溢的封固液去除。
實驗二 蜱的解剖與細胞培養(yǎng)
【實驗目的】
掌握蜱的解剖基本實驗技術，熟悉蜱的細胞培養(yǎng)技術。
【實驗原理】
對蜱進行解剖以掌握蜱的內部系統(tǒng)結構。通過體外給予蜱特定的理化條件和必需的基本營養(yǎng)成分進行細胞培養(yǎng)，以滿足多方面研究和防治工作的實際需要。
【實驗材料】
1. 蜱解剖所需實驗材料：解剖鏡、解剖針、解剖刀、玻片、平皿、生理鹽水或磷酸緩沖液、眼科鑷子、吸管、燒杯、石蠟、松香、酒精燈、小試管、試管架、胚胎皿、小燒杯等。
2. 蜱細胞培養(yǎng)所需實驗材料：絹紗袋、注射器芯、平皿、RPMI1640培養(yǎng)基、0.5%新潔爾滅、75%酒精、胰酶、EDTA溶液、無Ca2+、 Mg2+ 的Hanks液
【實驗方法】
1．解剖
首先是軀體固定，取一滴加熱融化的速干膠滴在潔凈的玻片上。將蜱背面向上，頭向前，用眼科鑷子將其平放在膠滴中間，1min左右即粘固在玻片上。然后是切除背板、背板的切除，從肩突開始，沿體側溝用手術刀做一個切環(huán)，直至對側肩突，再在假頭和背板上緣做一橫切。接下來是摘除背板，用眼科鑷子左手夾注已切開的背板左上側，右手用解剖針小心地由上往下緊帖背板，剝離粘在其上的支氣管束和結締組織，這時應將玻片放在盛有生理鹽水的平皿內。右手邊剝離左手邊向下拉，直到取盡為止。最后是取出消化器官等。以消化器官為例，用鑷子夾住中腸前部，用解剖針在食管部位將腸管切斷，再慢慢由上向下將剝離的消化器官取出，包括馬氏管、直腸囊、唾液腺、卵巢、睪丸等一起取下，分別放于胚胎皿中，依工作需要進行固定、組織切片或細胞培養(yǎng)。
2．細胞培養(yǎng)
以蜱卵為例，可先將蜱卵放于絹紗袋中，用蒸餾水漂洗2~3次，然后用0.5%新潔爾滅消毒10min，再用蒸餾水漂洗2~3次，放入75%酒精中消毒10min，再用蒸餾水漂洗2~3次，在用1640液漂洗1洗后于小平皿內用注射器芯擠壓破碎，去出卵殼后，接入培養(yǎng)液中進行原代培養(yǎng)。如需增加原代細胞的貼壁能力，可先在培養(yǎng)瓶中放入胎牛血清使瓶壁薄薄覆蓋，以增加原代細胞的貼壁能力。待細胞不斷生成，貼壁成單層后，可用胰酶消化分散細胞，可進行繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)時，首先要分散細胞，可采用胰酶溶液或EDTA溶液進行分散。分散時可先將原培養(yǎng)液棄去，用無Ca2+、 Mg2+ 的Hanks溶液洗2次，再加入胰酶消化液28℃消化2~5min，當細胞間隙松動，肉眼可見單層細胞呈“發(fā)毛”現(xiàn)象時，小心棄去消化液，反復搖動培養(yǎng)瓶，見細胞脫落時，將瓶用手掌輕輕一拍，使大片細胞脫落，然后用培養(yǎng)液將細胞從瓶壁吹下，分散成單個細胞，再依據(jù)細胞量進行分瓶培養(yǎng)。蜱細胞的凍存和復蘇，依照緩凍速復的原則進行。
【實驗結果】
1. 成功解剖蜱，見其內部系統(tǒng)結構，如下圖肩板硬蜱：
圖2-1 肩板硬蜱I. scapularis內部系統(tǒng)解剖圖
2. 對蜱卵成功培養(yǎng)。
【注意事項】
1. 速干膠不宜太熱將標本燙壞，也不宜太涼粘不住，用玻璃棒蘸起成滴狀即可。
2. 進行標本解剖時應將玻片放在盛有生理鹽水的平皿內，以覆蓋住蜱標本的水量即可，可避免內臟因干枯而破裂。
3. 原代培養(yǎng)時因組織和細胞剛剛離開機體，在人工環(huán)境中需要培養(yǎng)液更接近它原來的體液才有利于其生存和培養(yǎng)，應適當加大小牛血清或胎牛血清的含量（15%~30%)，必要時可加入蜱組織研磨液，以提供生長激素等彌補培養(yǎng)基營養(yǎng)差異。
4. 胰酶溶液要用無Ca2+、 Mg2+ 的Hanks液配制。
實驗三 革螨的標本及染色體標本的制備
【實驗目的】
（一) 掌握革螨成蟲的形態(tài)特征。
（二) 掌握革螨成蟲標本的采集、固定、制作、染色和保藏。
（三) 掌握同工酶技術在革螨中的應用，熟悉了解其他新技術、新方法在革螨診斷中的應用。
一、內容：
（一) 示教與觀察：
1． 革螨成蟲
2． 革螨蟲卵
（二) 技術操作：
1． 革螨的采集
動物巢穴和外界環(huán)境：動物巢穴中的革螨，無論種類、數(shù)量、蟲期、生態(tài)均較宿主體上的多而復雜。采集標本時，將巢穴內容物（窩草、糞土、雜物等)都收集到白布袋中，扎緊袋口并標簽。自由生活型革螨常棲息于枯枝爛葉下、稻草堆、住屋塵土、倉貯下層、糞堆等，按不同采集地點，分別存放于白布袋里，附上標簽及編號。
2． 革螨的收集
收集革螨最好用電熱集螨器方法，原理是利用熱、干燥和光驅使革螨爬到集螨器下端的收集管里。如無集螨器或少量標本，則可放于搪瓷盤內用長鑷子或解剖針逐一撥動被檢物，同上法取螨，同樣也要檢查布袋中的螨。
采到的革螨一般可直接放入70%酒精中保存，若用加熱約70℃的70%~80%酒精固定活螨或先用熱水約70℃燙一下再放酒精中固定，則可使螨體附肢伸直，制成的標本美觀且有利于鑒定。如需活螨則可直接挑入大型、中型或小型飼養(yǎng)器中飼養(yǎng)或觀察。
3． 革螨染色體標本的制備
玻璃紙壓片法
（1)取早期胚組織革螨卵，置于潔凈的載玻片或蓋玻片上。
（2)覆蓋1cm2左右玻璃紙，玻璃紙預先浸于45%冰醋酸水溶液中數(shù)分鐘。
（3)擊破卵殼，使胚細胞鋪展，靜置2~3min。
（4)壓片：在玻璃紙上再覆蓋一片吸水濾紙，用拇指均勻用力壓片。
（5)固定：滴加甲醇—冰醋酸（3:1)或96%酒精，反復固定3~5 min。
（6)染色：翻轉玻璃紙，用pH7.0的0.01mol/L磷酸緩沖液稀釋的5%Giemsa液染色30 min。
（7)水淋洗，待干、鏡檢、攝影。
（8)如螨卵較多，采用氣干法制片，效果更佳。
C分帶——BSG法
（1)取新鮮制備尚未染色的染色體標本，置于0.2N HCl中室溫下處理5 min。
（2)將標本浸入預熱至50~60℃的5%Ba(OH)2水溶液中10 min，取出用熱蒸餾水洗3次。
（3)于60℃的2×SSC（氯化鈉17.54g，枸緣酸鈉8.82g，蒸餾水加至1000ml)溶液中處理1h，水洗。
（4)用5%Giemsa液（同前)染色30~60 min。水洗、待干、鏡檢。著絲粒區(qū)呈深紫紅色，染色體其他部位呈淺紅色。
實驗四 恙螨標本恙蟲病東方體DNA的提取
【實驗目的】 掌握恙螨標本恙蟲病東方體DNA的提取
【實驗原理】 在EDTA（鰲合二價陽離子以抑制DNase)存在的情況下。用蛋白酶K消化真核細胞或組織，用去垢劑如SDS溶解細胞膜并使蛋白質變性。蛋白酶的作用是消化蛋白質，膜蛋白的消化對破壞膜結構對細胞裂解有巨大的促進作用；巨大的基因組 DNA 都是纏繞在大分子的蛋白（核小體)上的，當?shù)鞍踪|被蛋白酶消化變小后，基因組 DNA就被釋放出來，這樣一方面有利于蛋白質在純化操作中的去除，一方面釋放出更多的基因組 DNA 提高核酸的產(chǎn)量。
【實驗材料】
1. 恙螨標本：恙螨蒸餾水浸泡2h，中間換水1次，洗凈的恙螨置于研磨器，加適量的TE液研磨成懸液備用。
2．設備 移液管、高速冷凍離心機、臺式離心機、水浴鍋。
3．試劑
1)分離緩沖液：10mmol/L Tris·Cl pH7.4，10mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA。
2)10% SDS，蛋白酶 K（20mg/ml或粉劑)
3)乙醚，酚:氯仿:異戊醇（25:24:1)
4)其它試劑：無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。
【實驗方法】
1. 將恙螨TE研磨液(或其他標本的樣品)吸取100μl于Eppendorf管中，加1/10體積的10%十二烷基硫酸鈉（SDS)，混勻，置4℃冰箱過夜；
2. 加10 mg/ml 溶菌酶至終濃度為2mg/ml，冰浴30min，加10mg/ml蛋白酶K至終濃度為2mg/ml，55℃水浴1~2h。
3. 加入等體積的酚，混勻10min，離心5 000rpm 5min，吸出水相，用酚重新抽提一次；用氯仿-異戊醇重復抽提2次；
4. 加入1/20體積5M氯化鈉，2倍體積的無水乙醇，-20℃冰箱過夜，離心去上清，加入70%乙醇振蕩洗滌，去上清晾干，取20μl TE溶解沉淀，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
【實驗結果】
1. DNA溶液稀釋20-30倍后，測定OD260 /OD280比值， 明確DNA含量和質量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose膠上電泳， 檢測DNA的分子大小。
【注意事項】
1. 選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。
2. 在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成。
3. 抽提每一步用力要柔和，防止機械剪切力對DNA的損傷。
4. 取上層清液時，注意不要吸起中間的蛋白質層。
5. 乙醇漂洗去乙醇時，不要蕩起DNA。小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。
6. 離心后，不要晃動離心管，拿管要穩(wěn)，斜面朝外。
實驗五 粉螨的采集、分離和保存
【實驗目的】
學會粉螨的采集、分離和保存方法
【實驗原理】
了解了粉螨的孳生環(huán)境采集粉螨，粉螨有避光爬附性，粉螨足跗節(jié)端部多具爪墊，在爬行時能附著在物體表面上。
【實驗材料】
密封塑料袋5個、零號毛筆5支、平底搪瓷盤10個、黑紙板10個、凡士林、廣口瓶（及軟木塞)一個、指形管5個、脫脂棉、標簽紙、炭素筆
【實驗方法】
1. 采集：面粉廠的地腳粉，米廠的地腳米及其細糠，中藥廠剁藥車間的灰塵及碎藥材渣、沫，中藥材柜灰塵等；
2. 分離：選平底搪瓷盤蓋和黑紙板（遮光黑紙板或三合板上貼黑紙)，或在平皿內墊一黑紙（小樣本收集多采用平皿)，劃定面積作為爬附區(qū)；將樣本平展其上，置于光照之下，每隔15~20min把樣本輕輕拍轉到下一爬附區(qū)。若不計數(shù)每次爬附所獲得螨數(shù)，只是為了收獲粉螨，則可放置數(shù)小時（一般4~6h)，任其爬附。為了防止粉螨逃脫，在爬附區(qū)周圍可涂一圈粘性物質。最后用毛筆收集螨。
3. 保存：將采集到的粉螨直接制成玻片標本，或放在保存液中留待以后制作。常用的兩種保存液為：① 70％~80％乙醇；② 奧氏保存液（Oudemans fluid)。奧氏保存液的配方為：70％乙醇87份，冰醋酸8份，甘油5份。配制方法：將純酒精用蒸餾水稀釋到濃度70％后，加入冰醋酸和甘油，搖勻備用。
保存前，用零號毛筆（較小的粉螨可應用毛發(fā)針，毛發(fā)針即是在解剖針的針尖上粘l~2根毛發(fā)而成)“挑取”粉螨，放人濃度為50％~70％的熱酒精（70~80℃)中固定，使其肢體伸展，姿勢正常；再放入盛有奧氏保存液的指形管中，用脫脂棉塞塞口后，放人盛有同樣保存液的廣口瓶中，軟木塞塞口。對于少量粉螨標本，可用青霉素針劑瓶盛放標本，蓋子蓋緊后用膠布封嚴。應用碳素墨水筆記錄采集地點、時間、采集人姓名、寄主等，并隨粉螨標本一起放入盛有保存液的指形管中或小瓶中保存，此法也稱為雙重溶液浸漬法。
粉螨保存瓶
【實驗結果】收集并保存一定數(shù)量的粉螨
【注意事項】
1.所采集到的標本要根據(jù)時間、地點、材料的不同，單獨裝袋并加注標簽。防止交叉感染。
2.注意掌握粉螨的爬附時間，時間太短還未附著好，時間太長粉螨容易粘在凡士林上。
實驗六 粉螨標本的制作
【實驗目的】學會制作粉螨標本。
【實驗原理】粉螨可在封固劑中透明、保存，便于觀察鑒定。
【實驗材料】粉螨、毛發(fā)針、載玻片、蓋玻片、100％乳酸20ml、蒸餾水50ml、水合氯醛醛5g、甘油20ml、阿拉伯膠結晶30g、無色指甲油、電吹風
【實驗方法】
1．臨時標本
（1)臨時封固劑 ：50％～100％乳酸；將粉螨直接封入50％~100％乳酸中。
（2)將粉螨直接封入50％~100％乳酸中，放在約60℃的板上加熱，冷卻后即可。
2．永久標本
（1)永久封固劑 ：Faure改進的貝氏封固劑，配方為；蒸餾水50ml、水合氯醛醛5g、甘油20ml、阿拉伯膠結晶30g配制方法：按上述順序混合后用絹篩過濾，著過濾不暢，可稍微加熱后過濾。
（2) a. 直接用活螨制作標本，也可把保存液中保存的螨類，用吸管吸出并置濾紙上吸干以后制作標本。b. 用玻棒蘸取一些封固劑滴在載玻片中央2~3滴，將粉螨標本2~3只或更多置于封固劑中，用毛發(fā)針攪動，以清除粉螨軀體及足上的雜質，或者將分離的粉螨置于盛有清水的平皿內洗滌；c. 另取一塊滴加一滴封固劑的載玻片，將“洗浴”后的粉螨用毛發(fā)針移到封固劑中，加蓋玻片。d. 加熱：電吹風法是利用電吹風的熱風加熱玻片標本，當封固劑出現(xiàn)氣泡或開始沸騰時，停止加熱，冷卻后即可。此法容易掌握，制成的粉螨玻片標本透明，8足挺展。e. 玻片標本完全干燥后，在相對濕度較大的地區(qū)，可在蓋玻片四周涂封一層元色指甲油，以防封固劑發(fā)霉和回潮。f. 在玻片標本的右方粘貼標簽，標簽上寫明粉螨的學名和漢名、采集地點、采集時間、采集人姓名以及寄主等。
【實驗結果】 制作出粉螨臨時及永久標本
【注意事項】 封固劑的量要適當，以蓋玻片蓋上后正好鋪滿但不外溢為宜。對背面隆起的粉螨，可在封固劑中放人3~4塊碎蓋片后再加蓋玻片，以免標本被壓碎或變形。
螨類玻片標本制作程序
實驗七 大學生蠕形螨流行病學調查
【實驗目的】
1. 掌握蠕形螨檢查的常用方法
2. 了解本校大學生蠕形螨的感染率
【實驗原理】
蠕形螨寄生在人體的毛囊和皮脂腺內，利用擠壓或粘貼的物理方法，將蠕形螨檢出。
【實驗方法】
（1)擠壓刮拭法：用皮膚刮鏟或蘸水筆尖后鈍端從受檢部位皮膚，如鼻溝、鼻尖部、頰、頦等部位直接刮取皮脂。刮拭時，用雙手拇指相距l(xiāng)cm左右先壓后擠壓刮拭部位。將刮取的皮脂置于載玻片上，滴加適量70％甘油（一般1滴即可)，與之混勻，覆以蓋片即可鏡檢；若要以皮脂定量計算感染度，可將刮取的皮脂放入特制的皮脂定量檢螨器的定量糟內，然后取出置于載玻片上，按上述步驟涂片鏡檢，分別計數(shù)皮脂蠕形螨和毛囊蠕形螨的數(shù)量。
（2)透明膠紙法：囑被檢對象于睡眠前進行面部清潔（洗臉)，用寬1.2cm、長5cm的透明膠帶貼于受檢部位皮膚上，次晨揭下，貼回載玻片上鏡檢，如不夠透明可于膠紙上滴加少許70％甘油。此法可以面積定量計算螨的感染度，具有定時、定點、定量的優(yōu)點。
【實驗材料】
皮膚刮鏟、載玻片、透明膠紙、甘油等
【實驗結果】
【注意事項】
1．擠壓刮拭法操作時要注意力度，以免刮破皮膚，造成感染。
2．獲得的標本要立刻鏡檢，以防蠕形螨蟲體裂解。
實驗八 疥螨標本采集與制作保存技術
【實驗目的】
采集疥螨標本，再制片保存，以便進行形態(tài)學、生態(tài)學等科研及教學方面的研究。
【實驗原理】
將生活在“隧道”中的活疥螨采集，可用于生態(tài)學研究，或將疥螨標本固定后再制片保存以便進行形態(tài)學研究及教學。
【實驗材料】蓋玻片與載玻片、6號注射針頭、消毒手術刀、雙目解剖鏡、離心機、烤箱、蒸餾水、70％酒精或2％中性戊二醛、Berlese液或Hoyer液、聚乙烯醇、10％NaOH或KOH、60％，70％，80％，85％，90％，95％及100％酒精、加拿大樹膠。
【實驗方法】
1. 疥螨標本的采集：
(1)針挑法：選用消毒的6號注射針頭，持針與皮膚平面呈10°～20°角，針口斜面向上，在“隧道”末端距螨點約1mm處垂直于“隧道”長軸進針，直插至螨點底部并繞過螨體，然后放平針桿(呈5°～10°)并稍加轉動，疥螨即落入針口孔槽內，緩慢挑破皮膚或直接退出針頭。
(2)解剖鏡鏡檢法：讓就診者將手及掌腕部置于4×10或2.5×10的雙目解剖鏡視野下，檢查者利用45°角入射的強光源(100瓦普通燈泡)，在其指側及掌腕等嫩薄皮膚的皮損處觀察，可清晰的看到疥瘡患者的疥螨“隧道”及其內的疥螨輪廓和所在部位。然后，用消毒的尖頭手術刀挑出。
采集的疥螨標本應先用70％酒精或2％中性戊二醛固定4～5d后再制片保存，以便進行形態(tài)學等方面的研究。
2. 疥螨標本的制作
(1)半永久性標本制作法：用Berlese液或Hoyer液等水溶性封固劑制片，按封固恙螨幼蟲標本的方法操作。但是這些封固劑中的水合氯醛和甘油都會吸收水分，易使烤干的標本反潮、混濁。因此，必須用干漆或聚乙烯醇在蓋玻片周圍加邊，以延長保存時間，若制片標本放置日久，標本出現(xiàn)過透明，使疥螨結構模糊，或蓋玻片內產(chǎn)生氣泡和霉菌時，可將蓋玻片周圍的干漆或聚乙烯醇用小刀輕輕刮掉，然后將標本插入載玻片缸內，用蒸餾水浸泡2～3d，至蓋玻片與載玻片自動分離后，取出螨體，再用上述同樣方法制片。
(2)永久性標本封片法：將固定后的標本，浸泡在10％NaOH或KOH水溶液中4～8h，然后水洗3次，每次10～20min，繼而經(jīng)60％，70％，80％，85％，90％，95％及100％酒精脫水，在每級酒精內的脫水時間為10min，再經(jīng)冬青油透明后，用中性加拿大樹膠封片。為了避免疥螨標本在操作中丟失，因此腐蝕、水洗、脫水、透明的全過程，要在離心沉淀的條件下進行，每次離心沉淀1 500 r/min，5min。借助解剖鏡，選取完美的標本，用加拿大樹膠封固后，平放在50～60℃的烤箱內烤干保存。
【實驗結果】
采到結構完整、活動度好的活疥螨；制作的標本應觀察到結構清晰、完整，透明度較好的疥螨。
【注意事項】
1. 針挑法在持針與皮膚平面呈10°～20°角，針口斜面向上，動作輕柔，否則得到的螨體將不完整。
2. 半永久性標本制作時必須用干漆或聚乙烯醇在蓋玻片周圍加邊，以延長保存時間。
3. 永久性標本封片法時，為了避免疥螨標本在操作中丟失，因此腐蝕、水洗、脫水、透明的全過程，要在離心沉淀的條件下進行。
實驗九、PCR技術在蜱螨學研究中的應用
【實驗目的】
１、熟悉PCR技術的原理。
２、掌握PCR技術的操作步驟。
【實驗原理】
PCR（Polymerase ChainReaction，聚合酶www.med126.com鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法。它包括三個基本步驟：（1)變性（Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；（2)退火（Anneal)：兩種寡核苷酸引物在適當溫度（50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；（3)延伸（Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成。由這三個基本步驟組成一輪循環(huán)，理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴增一倍，這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板，所以經(jīng)25～35輪循環(huán)就可使DNA擴增達106 倍。
一、 PCR反應中的主要成份
1、引物：PCR反應產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區(qū)域時可遵循下列原則：（1)引物長度約為16-30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費，且難以合成。（2)引物中G+C含量通常為40%～60%，可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4（G+C)+2（A+T)。（3)四種堿基應隨機分布，在3"端不存在連續(xù)3個G或C，因這樣易導致錯誤引發(fā)。（4)引物3"端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應，以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。（5)在引物內，尤其在3"端應不存在二級結構。（6)兩引物之間尤其在3"端不能互補，以防出現(xiàn)引物二聚體，減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。 （7)引物5"端對擴增特異性影響不大，可在引物設計時加上限制酶位點、核糖 體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等。 通常應在5"端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。（8)引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結構，以免產(chǎn)生非特異性擴增，影響產(chǎn)量。（9)簡并引物應選用簡并程度低的密碼子，例如選用只有一種密碼子的Met，3"端應不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴增產(chǎn)物。
一般PCR反應中的引物終濃度為0.2～1.0µmol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導或產(chǎn)生引物二聚體，過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計，可精確計算引物濃度，在1cm光程比色杯中，260nm下，引物濃度可按下式計算：
X mol/L＝OD260/ A（16000)+C（70000)+G（12000)+T（9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿基個數(shù)。
2、4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP)：dNTP應用NaOH將pH調至7.0，并用分光光度計測定其準確濃度。dNTP原液可配成5～10mmol/L并分裝，-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20～200μmol/L。理論上4種dNTP各20μmol/L，足以在100μl反應中合成2.6μg的DNA。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等，以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。
3、Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大，它可影響酶的活性和真實性，影響引物退火和解鏈溫度，影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5～2mmol/L。對于一種新的PCR反應，可以用0.1～5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進行預備實驗，選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應混合物中，應盡量減少有高濃度的帶負電荷的基團，例如磷酸基團或EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質，以保證最適Mg2+濃度。
4、模板：PCR反應必須以DNA為模板進行擴增，模板DNA可以是單鏈分子，也可以是雙鏈分子，可以是線狀分子，也可以是環(huán)狀分子（線狀分子比環(huán)狀分子的擴增效果稍好)。就模板DNA而言，影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度。一般反應中的模板數(shù)量為102～105個拷貝，對于單拷貝基因，這需要0.1μg的人基因組DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大腸桿菌DNA。擴增多拷貝序列時，用量更少。靈敏的PCR可從一個細胞，一根頭發(fā)，一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列。模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物。DNA中的雜質也會影響PCR的效率。
5、Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min�，F(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶，這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時間。Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74℃下，30min，摻入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一個致命弱點是它的出錯率，一般PCR中出錯率為2×10-4核苷酸/每輪循環(huán)，在利用PCR克隆和進行序列分析時尤應注意。在100μl PCR反應中，1.5～2單位的Taq DNA聚合酶就足以進行30輪循環(huán)。所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進行適當?shù)脑鰷p。酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加，過少則使產(chǎn)量降低。反應結束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進行下一步實驗，需要預先滅活Taq DNA聚合酶，滅活Taq DNA聚合酶的方法有：（1)PCR產(chǎn)物經(jīng)酚：氯仿抽提，乙醇沉淀。（2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。（3)99～100℃加熱10min。目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。
6、反應緩沖液：反應緩沖液一般含10～50mmol/L Tris·Cl（20℃下pH8.3～8.8)，50mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+。Tris·Cl在20℃時pH為8.3～8.8，但在實際PCR反應中，pH為6.8～7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇（DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA)，它們可穩(wěn)定酶活性，另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴增較長的DNA片段有利。各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。
二、PCR反應參數(shù)
1、變性：在第一輪循環(huán)前，在94℃下變性5～10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶（hotstart)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性，減少DNA產(chǎn)量。一般變性溫度與時間為94℃ 1min。在變性溫度下，雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時間主要是為使反應體系完全達到適當?shù)臏囟取τ诟缓珿C的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。
2、退火：引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃。一般當引物中GC含量高，長度長并與模板完全配對時，應提高退火溫度。退火溫度越高，所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并，只用兩種溫度（例如用60℃和94℃)完成整個擴增循環(huán)，既省時間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應中所需時間主要是為使整個反應體系達到合適的溫度。通常退火溫度和時間為37℃～55℃，1～2min。
3、延伸：延伸反應通常為72℃，接近于Taq DNA聚合酶的最適反應溫度75℃。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為Taq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃～85℃。延伸反應時間的長短取決于目的序列的長度和濃度。在一般反應體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時間過長會導致產(chǎn)物非特異性增加。但對很低濃度的目的序列，則可適當增加延伸反應的時間。一般在擴增反應完成后，都需要一步較長時間（10～30min)的延伸反應，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。
4、循環(huán)次數(shù)：
當其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25～30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多，會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25～30輪循環(huán)擴增后，反應中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足，如果此時產(chǎn)物量仍不夠醫(yī)學全.在線，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品稀釋103～105倍作為模板，重新加入各種反應底物進行擴增，這樣經(jīng)60輪循環(huán)后，擴增水平可達109～1010 。
擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關，擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示：C＝C0（1+P)n。其中：C為擴增產(chǎn)物量，C0為起始DNA量，P為增效率，n為循環(huán)次數(shù)。
在擴增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴增的反應變成平坦的曲線，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結束反應，減少非特異性產(chǎn)物。
第二節(jié) 材料、設備及試劑
一、材料
不同來源的模板DNA。
二、設備
移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴增儀（PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設備（電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機。
三、試劑：
1. 10×PCR反應緩沖液：500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0%Triton X-100。
2. MgCl2：25mmol/L。
3. 4種dNTP混合物：每種2.5mmol/L。
4. Taq DNA聚合酶5U/μl。
5. 其它試劑：1%瓊脂糖，5×TBE。
第三節(jié) 操作步驟
一、PCR反應
1.依次混勻下列試劑
| H2O | 35μl |
| 10×PCR反應緩沖液 | 5μl |
| 25mmol/L MgCl2 | 4μl |
| 4種dNTP | 4μl |
| 上游引物（引物1) | 0.5μl |
| 下游引物（引物2) | 0.5μl |
| 模板DNA（約1ng) | 0.5μl |
混勻后離心5秒。
2.將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。
3.用94℃變性1min，45℃退火1min，72℃延伸2min，循環(huán)35輪，進行PCR。最后一輪循環(huán)結束后，于72℃下保溫10min，使反應產(chǎn)物擴增充分。
二、電泳
取10μl擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，檢查反應產(chǎn)物及長度。
【注意事項】
1、PCR非常靈敏，操作應盡可能在無菌操作臺中進行。
2、吸頭、離心管應高壓滅菌，每次吸頭用畢應更換，不要互相污染試劑。
3、加試劑前，應短促離心10秒鐘，然后再打開管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側面。
4、應設含除模板DNA所有其它成分的負對照。
【思考題】
1、降低退火溫度對反應有何影響？
2、延長變性時間對反應有何影響？
3、循環(huán)次數(shù)是否越多越好？為何？
4、如果出現(xiàn)非特異性帶，可能有哪些原因？
皖南醫(yī)學院 病原生物學碩士點
2006．7．3
