醫(yī)學分子生物學教案
第 8-10 次課 授課時間：2009年10月19日-11月6日
| 課程名稱 | 醫(yī)學分子生物學 | 年級 | 2007 | 專業(yè)、層次 | 臨床醫(yī)學 | |||||||
| 授課教師 | 于海清 | 職稱 | 講師 | 課型（大、小) | 大 | 學時 | 9 | |||||
| 授課題目（章、節(jié)) | 第十九章 基因操作 | |||||||||||
| 基本教材及主要參考書 | 藥立波 主編. 醫(yī)學分子生物學(第3版). 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2008 馮作化 主編. 醫(yī)學分子生物學. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001 | |||||||||||
| 教學目的與要求： 目的：理解和掌握核酸的一般理化特性；核酸分子雜交的原理。理解和掌握PCR技術(shù)的基本原理；基因文庫、cDNA文庫的概念。理解和掌握基因克隆的概念；限制酶的概念；基因克隆的必要條件；基因克隆的基本步驟。理解和掌握原核表達系統(tǒng)的特點；真核表達系統(tǒng)的特點；基因轉(zhuǎn)染的概念。理解和掌握直接分析基因一級結(jié)構(gòu)的方法；基因定向突變的概念。理解和掌握核酸探針的概念；Southern印跡分析的基本原理；Southern印跡分析的基本過程。理解和掌握Northern印跡的概念；Northern印跡分析的基本過程；實時RT-PCR的基本原理。理解和掌握轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的概念；轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的基本過程；基因打靶的概念；RNA干擾技術(shù)的概念；RNA干擾的基本原理；RNA干擾技術(shù)的基本流程。 要求： 1. 核酸的一般理化特性；核酸分子雜交的原理。 2. PCR技術(shù)的基本原理；基因文庫、cDNA文庫的概念。 3. 基因克隆的概念；限制酶的概念；基因克隆的必要條件；基因克隆的基本步驟。 4. 原核表達系統(tǒng)的特點；真核表達系統(tǒng)的特點；基因轉(zhuǎn)染的概念。 5. 直接分析基因一級結(jié)構(gòu)的方法；基因定向突變的概念。 6. 核酸探針的概念；Southern印跡分析的基本原理；Southern印跡分析的基本過程。 7. Northern印跡的概念；Northern印跡分析的基本過程；實時RT-PCR的基本原理。 8. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的概念；轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的基本過程；基因打靶的概念；RNA干擾技術(shù)的概念；RNA干擾的基本原理；RNA干擾技術(shù)的基本流程。 | ||||||||||||
| 教學內(nèi)容與時間安排、教學方法： 內(nèi)容： 1. 核酸的理化性質(zhì)。 10分鐘 2. 基因的獲取。 70分鐘 3. 基因的克隆。 80分鐘 4. 克隆基因的表達。 20分鐘 5. 基因結(jié)構(gòu)的分析及改造。 30分鐘 6. 基因的拷貝數(shù)分析。 30分鐘 7. 基因表達的分析。 40分鐘 8. 基因功能的分析。 80分鐘 方法：盡量使用圖片簡圖加深感性認識，總結(jié)對比增強辨識力，動畫演示有助于理解。研究進展和報告增加應(yīng)用實例，布置一些內(nèi)容自學，嘗試課堂提問或討論。 | ||||||||||||
| 教學重點及如何突出重點、難點及如何突破難點： 重點：核酸的一般理化特性；核酸分子雜交的原理。PCR技術(shù)的基本原理；基因文庫、cDNA文庫的概念。基因克隆的概念；限制酶的概念；基因克隆的必要條件；基因克隆的基本步驟。原核表達系統(tǒng)的特點；真核表達系統(tǒng)的特點；基因轉(zhuǎn)染的概念。直接分析基因一級結(jié)構(gòu)的方法；基因定向突變的概念。核酸探針的概念；Southern印跡分析的基本原理；Southern印跡分析的基本過程。Northern印跡的概念；Northern印跡分析的基本過程；實時RT-PCR的基本原理。轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的概念；轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的基本過程；基因打靶的概念；RNA干擾技術(shù)的概念；RNA干擾的基本原理；RNA干擾技術(shù)的基本流程。 對于重點內(nèi)容，教學過程中應(yīng)注意著重強調(diào)，以提醒學生注意。 難點：PCR技術(shù)的基本原理；Southern印跡分析的基本原理；Southern印跡分析的基本過程。Northern印跡分析的基本過程；實時RT-PCR的基本原理。RNA干擾的基本原理；RNA干擾技術(shù)的基本流程。 有關(guān)基因操作的技術(shù)方法，由于感性認識缺乏，理解起來較困難，應(yīng)多使用圖片和動畫以助學生理解。 | ||||||||||||
| 教研室審閱意見： 教研室主任簽名： 年 月 日 | ||||||||||||
| 基本內(nèi)容 | 教學手段 | 課堂設(shè)計和時間安排 | ||||||||||
| 第十九章基因操作 （一) ――――――――――――――――― 基因工程： 又叫DNA重組技術(shù)、DNA克隆、分子克隆。特定基因（目的基因、外源DNA片段)的制備、分離、鑒定、改造及在不同生物間的轉(zhuǎn)移技術(shù)。核心操作對象是DNA分子 基因操作：所有涉及DNA和RNA的操作技術(shù) | （★－重點，☆－難點)
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| 第一節(jié) 核酸的理化性質(zhì) 核酸的一般理化特性 1. 核酸的酸堿及溶解度性質(zhì) ¨ 核酸具有磷酸基和堿基，兩性大分子，偏酸性 ¨ DNA的等電點為4～4.5，RNA的等電點為2～2.5 ¨ 可與金屬離子成鹽，不溶于乙醇或異丙醇 2. 核酸的高分子性質(zhì) ¨ 粘度：DNA>RNA，dsDNA>ssDNA ¨ 離心場的沉降行為 3. 核酸的紫外吸收 ¨ OD260: 單核苷酸>ssDNA或RNA>dsDNA | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：核酸的一般理化性質(zhì)。 (8分鐘)
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| 核酸分子雜交的原理 1. 原理 • 定義 理化因素作用下，DNA雙鏈解開形成兩條單鏈的過程 • 方法 過量酸、堿、加熱、變性試劑（尿素、酰胺、乙醇) • 變性后理化性質(zhì)的變化 OD260增高，粘度下降，比旋度下降，浮力密度升高，酸堿滴定曲線改變，生物活性喪失 2. DNA復性 DNA復性：適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構(gòu)象 • 退火annealing：熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻即可復性 • 退火時DNA的復性速度受溫度影響，低于Tm 25℃時，DNA復性條件最佳 • 減色效應(yīng)：DNA復性時，其溶液OD260降低 3. 核酸分子雜交（hybridization) ¨ 雜化雙鏈：DNA變性后進行復性過程中，將不同種類的ssDNA或RNA分子放在同一溶液中，單鏈分子間存在堿基配對關(guān)系，條件適宜（溫度、離子)就可以形成分子間雜化雙鏈（heteroduplex) ¨ 類型：DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA 3. 核酸分子雜交的應(yīng)用 ¨ 研究DNA分子中某一種基因的位置 ¨ 鑒定兩種核酸分子間的序列相似性 ¨ 檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否 ¨ 基因芯片技術(shù)的基礎(chǔ) | 討論 | 講解：簡單回顧生物化學的DNA的變性與復性內(nèi)容，借此說明核酸分子雜交的原理。 (2分鐘)
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| 第二節(jié) 基因的獲取 用PCR技術(shù)獲取基因 1. PCR技術(shù)（聚合酶鏈式反應(yīng)，polymerase chain reaction) ¨ 是根據(jù)DNA半保留復制和DNA聚合酶的特性建立起 來的體外復制擴增DNA片段的技術(shù) ¨ 可將微量目的DNA在體外擴增100萬倍以上 ¨ Kary B. Mulis，1985年發(fā)明，1993年諾貝爾化學獎 ¨ 由一對分別5’端和3’端寡核苷酸片段為引物，在4種dNTPs和耐熱DNA聚合酶的作用下，合成復制模板DNA，使目的DNA得到體外擴增的技術(shù) 2. PCR技術(shù)原理 • 由一對分別5’端和3’端寡核苷酸片段為引物，在4種dNTPs和耐熱DNA聚合酶的作用下，合成復制模板DNA，使目的DNA得到體外擴增的技術(shù) 3. 引物的化學本質(zhì)是什么？ 單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段 ¢ DNA復制引物：單鏈RNA片段 ¢ PCR引物：單鏈DNA片段 4. PCR基本步驟 PCR循環(huán)三步曲： ¢ 變性（denaturation) ¢ 退火（annealing) ¢ 延伸（extension) 5. PCR反應(yīng)溫度設(shè)置的依據(jù) ¢ 變性：94℃左右，氫鍵斷裂，不影響單鏈構(gòu)象 ¢ 退火：55℃左右，氫鍵形成，錯配幾率低 ¢ 延伸：70℃左右，氫鍵形成/斷裂相持，酶活性溫度 6. PCR反應(yīng)系統(tǒng)組分 ¢ 模板DNA：高溫變性 ¢ Taq DNA聚合酶：耐高溫 ¢ dNTP：底物 ¢ 引物：DNA，人工合成 ¢ Mg2+：酶活性激活劑 7. 模板DNA： ¢ DNA、RNA都可以作為模板，如果是RNA可以先反轉(zhuǎn)錄成cDNA再作模板。模板DNA用量為102-105拷貝 ¢ 1μg人基因組DNA=3 × 105單拷貝 8. 特異性引物： ¢ 長度：15-30 mer（核苷酸數(shù)) ¢ G+C含量：40%-60% ¢ 退火溫度：Tm=4（G+C)+ 2（A+T) ¢ 引物序列：1對引物間不能有互補序列 ¢ 引物3’端：必須嚴格與模板互補 ¢ 引物5’端：可加酶、標記物、引入突變位點等 ¢ 引物濃度：0.1-1μmol/L 9. DNA聚合酶： ¢ Klenow片段：PCR早期，使用的大腸桿菌DNA聚合酶I的片段，不耐高溫（93-95℃)，需不斷添加酶 ¢ Taq DNA聚合酶：水生棲熱菌（Thermus aquaticus) ¢ 延伸速度：72℃下，延伸速度60 nt/s ¢ 半衰期：92 ℃ >2h，95℃ 40min，97 ℃ 5min 10. PCR產(chǎn)物 ¨ PCR擴增終產(chǎn)物: 介于兩條退火引物5′末端之間的雙鏈DNA片段，指數(shù)增長2n ¨ 引物延伸產(chǎn)物： 比兩引物限定區(qū)長的延伸產(chǎn)物，僅發(fā)生在以原始模板DNA為模板的擴增過程中，倍數(shù)擴增2n ¨ PCR平臺效應(yīng)（plateau effect): PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進入靜止期即平臺期 ¨ PCR擴增終產(chǎn)物產(chǎn)量： • Y=A（1+E)n Y: 擴增產(chǎn)物的量 A: 最初靶DNA分子數(shù) E: PCR擴增效率 n: 循環(huán)次數(shù) E＝100％, A=1，Y=2n >>2n (引物延伸產(chǎn)物量) ¨ PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析 | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：PCR技術(shù)的基本原理；PCR技術(shù)的應(yīng)用。 (30分鐘)
――――第1節(jié)課結(jié)束―――
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| 用反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)獲取基因 1. 反轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù) ¨ 以mRNA為模板，先進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA（complementary DNA，cDNA)，再進行PCR反應(yīng) ¨ RT-PCR與PCR區(qū)別： • 模板為mRNA • 需要逆轉(zhuǎn)錄酶 • 產(chǎn)物為cDNA ¨ 逆轉(zhuǎn)錄酶 ① AMV（禽成髓細胞性白血病病毒) Avian myeloblastosis virus 酶活性最適溫度42 ℃ ② MML中國衛(wèi)生人才網(wǎng)V（小鼠白血病病毒) Moloney murine leukemia virus 最適溫度37 ℃ 2. PCR技術(shù)的其他用途 ¨ 基因的體外突變 ¨ DNA和RNA的微量分析 ¨ DNA序列測定 ¨ 基因突變分析 3. PCR應(yīng)用舉例 ① 遺傳病診斷：鐮狀細胞貧血m.bhskgw.cn/rencai/ β6 Glu-Val (GAG-GUG) PCR擴增β6 DNA區(qū)域 ② 傳染病診斷：HBV和HIV ③ 腫瘤分子標志診斷： bcr-abl(慢性粒細胞白血病) PML/RARα(急性早幼粒細胞白血病) ④ 個體識別：親子鑒定與刑事偵破 ⑤ 生物考古：恐龍復活？ | 討論 簡圖 動畫 | 講解： 反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的基本原理；PCR技術(shù)的應(yīng)用。 (10分鐘)
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| 從基因文庫中獲取基因 1. 基因文庫（gene library )： 包括基因組文庫（genomic library)和cDNA文庫（cDNA library)，可作為模板，經(jīng)PCR或分子雜交 而獲得基因 2. 基因組文庫： 含有某種生物體全部基因片段的重組DNA克隆群體 3. cDNA文庫： 含有某一組織細胞中全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA片段的克隆群體，具有時空特異性 4. 基因組文庫的構(gòu)建步驟 ①提取染色體DNA：機械法或限制性內(nèi)切酶切割 ② 獲得適當大小的DNA片段 ③ 插入適當克隆載體 ④ 轉(zhuǎn)入受體菌擴增 ⑤ 得基因組文庫 5. cDNA文庫的構(gòu)建步驟 ① 提取細胞總mRNA ② 反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶作用，雙鏈cDNA ③ 插入適當克隆載體 ④ 轉(zhuǎn)入受體菌擴增 ⑤ 得cDNA文庫 | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：基因文庫、cDNA文庫的概念�；蛭膸臁DNA文庫的構(gòu)建及獲取基因的過程。 (25分鐘)
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| 人工合成基因 已知目的基因的堿基序列，可用DNA合成儀直接合成此基因的各個片段，最后用其他反應(yīng)將片段連接 優(yōu)點： • 可修飾基因 • 可在基因兩端涉及接頭 • 可選擇各種生物偏愛的密碼子 | 討論 | 講解： 反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)的基本原理；PCR技術(shù)的應(yīng)用。 (5分鐘)
――――第2節(jié)課結(jié)束―――
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| 第三節(jié) 基因的克隆 1. 基因克隆的概念 克隆clone： 通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體 基因克隆gene cloning： 把生物體中的一個基因通過無性繁殖轉(zhuǎn)入另一個生物體內(nèi)的過程。通過基因克隆可以得到一群完全相同的基因片段，由于基因就是DNA分子，所以也稱其為DNA克隆，是基因操作的核心技術(shù) 2. 基因重組gene recombination 利用DNA連接酶，將不同DNA片段連接起來構(gòu)成一個新DNA分子的過程，是分子生物學的核心技術(shù) u 自然界不同生物間的基因重組經(jīng)常發(fā)生 u 這啟發(fā)人們在20世紀70年代建立此技術(shù)，改變生物的遺傳信息 u 胰島素、生長激素、干擾素、細胞因子及多種單克隆抗體等基因工程藥物已上市 u 抗病、抗蟲、品質(zhì)改良的新品種、轉(zhuǎn)基因大豆、棉花、玉米和油菜的面積大增 3. 限制酶的概念 （1)限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase) • 專一識別DNA序列，在識別位點將其雙鏈切斷 • 限制性內(nèi)切酶（Endonucleosase)的發(fā)現(xiàn)：50年代初發(fā)現(xiàn)細菌的限制－修飾系統(tǒng) • 細菌的限制與修飾分子機理： • hsd M---限制性甲基化酶 • hsd S ---控制兩個系統(tǒng)的表達 （2)絕大多數(shù)的II類限制性內(nèi)切酶在底物DNA上的識別順序為4~8個核苷酸回文序列（Palindromic) （3)切割位點： 平頭末端（ blunt end) 和 粘性末端（sticky end) 4. 基因克隆的必要條件 （1)克隆載體vector • 攜帶目的基因進入宿主細胞的DNA分子 • 載體來源：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、病毒載體 • 質(zhì)粒是最常用的克隆載體 （2)必要條件： 目的基因：原核、真核基因… • 克隆載體：質(zhì)粒、病毒載體… • 工具酶類：內(nèi)切酶、連接酶… • 宿主細胞：細菌、動物細胞… | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)： ★ ☆基因克隆的概念。(5分鐘) ★ ☆限制酶的概念。(10分鐘) ★ ☆基因克隆的必要條件。(25分鐘)
――――第3節(jié)課結(jié)束―――
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| 小 結(jié) | 核酸的理化特性。 基因的獲取方法。 基因克隆的必要條件 (2分鐘)
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| 復 習 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 1. 什么是DNA的增色效應(yīng)？ 2. 如何判斷核酸樣品的純度？ 3. 核酸分子雜交的原理是什么？ 4. 核酸復性與退火所依據(jù)的原則是什么？ 5. 基因獲取的基本方法有哪些？ 6. 設(shè)計PCR引物需要考慮的因素有哪些？ 7. PCR引物如何與模板結(jié)合？ 8.如何設(shè)定PCR的反應(yīng)溫度？ 9. PCR引物如何與模板結(jié)合？ 10. PCR技術(shù)的基本過程是什么？ 11. 什么是基因克��？ 12. 什么是限制酶？它在基因克隆操作中有何用途？ 13. 基因克隆的必要條件有哪些？
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| 下 次 課 預 習 要 點 | 1. 基因克隆的基本步驟。 2. 原核表達系統(tǒng)的特點；真核表達系統(tǒng)的特點；基因轉(zhuǎn)染的概念。 3. 直接分析基因一級結(jié)構(gòu)的方法；基因定向突變的概念。 4. 核酸探針的概念；Southern印跡分析的基本原理；Southern印跡分析的基本過程。
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| 實 施 情 況 及 分 析 |
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| 基本內(nèi)容 | 教學手段 | 課堂設(shè)計和時間安排 | ||||||||||
| 第十九章基因操作 （二) ――――――――――――――――― | （★－重點，☆－難點)
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| 第三節(jié) 基因的克隆 1. 基因克隆的基本步驟 ① 酶切：制備目的基因和載體 ② 連接：目的基因和載體的連接 ③ 轉(zhuǎn)化：重組的DNA導入受體細胞 ④ 篩選：DNA重組體的篩選和鑒定 （1)目的基因的獲得：PCR、RT-PCR、基因組或cDNA文庫、人工合成 （2)載體的選擇 （3)目的基因與載體的連接 粘性末端、人工接頭、同聚體尾、平端連接 （4) 重組DNA導入宿主細胞 • 轉(zhuǎn)化（transformation) • 轉(zhuǎn)導（infection) • 轉(zhuǎn)染（transfection) ¢ 轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細菌主動或被動攝取外源DNA的過程 l 熱激法是最常用的轉(zhuǎn)化方法 l CaCl2處理，增加細胞壁通透性(0-50C) ，得感受態(tài)細菌 l 420C將細菌與重組的質(zhì)粒DNA溫育 （5) 重組DNA的篩選鑒定 • 遺傳學方法：抗生素、藍白斑篩選 • 核酸雜交法 • 菌落PCR法 • 免疫學方法 藍白斑篩選過程： ¨ α互補：載體具有l(wèi)acZ的調(diào)控序列和氨基端編碼區(qū)，宿主細胞具有l(wèi)acZ的羧基端編碼區(qū) ¨ IPTG存在時β-半乳糖苷酶將底物X-Gal轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物， 得到藍色菌落 ¨ 載體的多克隆區(qū)域，克隆上插入片段導致α-肽編碼區(qū)的 破壞，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落 2. 克隆過程舉例：結(jié)合課題項目講解 | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)： 基因克隆的基本步驟。(25分鐘) 基因克隆過程的應(yīng)用舉例。(15分鐘)
――――第1節(jié)課結(jié)束―――
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| 第四節(jié) 克隆基因的表達 原核表達系統(tǒng) 1. 表達系統(tǒng) ¢ 原核細胞表達系統(tǒng)：大腸桿菌 ¢ 真核細胞表達系統(tǒng)： 酵母、昆蟲、中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary Cell，CHO) （1)原核表達載體 ¢ pBV220、pET等，商品化供應(yīng) ¢ 結(jié)構(gòu)特點： 攜帶克隆基因的表達載體，在原核生物中表達所必備的表達調(diào)控序列： （2)蛋白表達方式 ¢ 非融合表達 表達產(chǎn)物直接是單一目的蛋白 ¢ 融合表達 表達產(chǎn)物不僅僅含有目的蛋白，還帶有一段融合的其他標簽序列，用于檢測和純化。最后應(yīng)用時，可能需要切除標簽部分 （3)原核表達載體的優(yōu)缺點 優(yōu)點： ¢ 表達系統(tǒng)簡單，容易操作 ¢ 成本低，易于大量生產(chǎn) ¢ 生長周期短 缺點： ¢ 需要翻譯后修飾的蛋白，不能用此表達系統(tǒng) | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：原核表達系統(tǒng)的特點。 (10分鐘)
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| （4)真核表達系統(tǒng) ¢ 質(zhì)粒載體和病毒載體 ¢ 調(diào)控表達元件最初多來源于病毒 ¢ 將重組真核載體導入真核細胞的過程稱為基因轉(zhuǎn)染 （5)真核細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點 優(yōu)點： ¢ 可表達需要翻譯后修飾的蛋白（糖基化修飾) 高雪病（葡糖腦苷脂沉積病)：缺乏β－葡萄糖腦苷脂酶 ，吞噬糖脂的巨噬細胞使肝脾腫大 缺點： ¢ 表達系統(tǒng)相對復雜 ¢ 成本高 ¢ 生長周期長 | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：真核表達系統(tǒng)的特點�；蜣D(zhuǎn)染的概念 (10分鐘)
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| 第五節(jié) 基因結(jié)構(gòu)的分析 基因的一級結(jié)構(gòu)分析 1. 直接分析基因的一級結(jié)構(gòu) • 雙脫氧末端終止法（Sanger法) • 化學裂解法（Maxam-Gilbert法) ¨ 雙脫氧末端終止法原理 用4種2’，3’-雙脫氧核苷酸ddNTP代替部分脫氧核苷酸dNTP作為底物，進行DNA合成反應(yīng)，從而獲得在不同部位終止反應(yīng)的大小不同的DNA鏈，經(jīng)高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE分離，對DNA序列進行分析 2. 間接分析基因的一級結(jié)構(gòu) 方法： 限制性片段長度多態(tài)性RFLP PCR-限制性片段長度多態(tài)性PCR-RFLP 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析SSCP 用途： 粗略分析未知DNA片段 分析過長的DNA片段 大量篩選DNA樣本 3. RNA水平分析基因的結(jié)構(gòu) 剪接異構(gòu)體、剪接部位、內(nèi)含子位置分析 RNA酶保護試驗：只能切斷單鏈RNA | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：Sanger法DNA序列測定的基本原理。(15分鐘) ★ RNA酶保護試驗的基本原理。 (5分鐘)
――――第2節(jié)課結(jié)束―――
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| 基因的改造 • PCR法改變基因一級結(jié)構(gòu)（堿基組成的變化) • 基因序列中的特定堿基稱作基因定向突變 | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：基因定向突變的概念及基本程序。 (10分鐘)
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| 第六節(jié) 基因的拷貝數(shù)分析 Southern blot基本原理： • 全基因組DNA樣品制備，電泳分離，轉(zhuǎn)移到固相膜支持物，與探針變性復性，利用核酸分子雜交的堿基互補配對原理，檢測目的基因中的互補序列，根據(jù)探針信號的位置和次數(shù)判斷基因拷貝數(shù) • 檢測對象：用DNA探針檢測DNA樣品 Southern blot基本過程： ¨ 模板DNA的準備：酶切，變性，電泳，轉(zhuǎn)膜 ¨ 核酸探針的標記：DNA，cDNA和寡核苷酸探針 化學法和酶促法 ¨ 核酸雜交反應(yīng)：探針變性，雜交，洗膜，自顯影 | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：核酸探針的概念；Southern印跡分析的基本原理。(15分鐘) ★ Southern印跡分析的基本過程。(15分鐘)
――――第3節(jié)課結(jié)束―――
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| 小 結(jié) | 基因克隆的基本步驟。 原核表達系統(tǒng)的特點；真核表達系統(tǒng)的特點；基因轉(zhuǎn)染的概念。 直接分析基因一級結(jié)構(gòu)的方法；基因定向突變的概念。 核酸探針的概念；Southern印跡分析的基本原理和基本過程。 (2分鐘)
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| 復 習 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 1. 基因克隆的基本步驟包括哪些？ 2. 常用的基因克隆載體有哪些？ 3. 怎樣進行目的基因與載體DNA的重組操作？ 4. 將重組DNA導入宿主細胞中進行擴增的方法有哪些？ 5. 怎樣篩選和鑒定目的基因？ 6. 如何實現(xiàn)克隆基因在原核或真核生物中表達？ 7. 影響克隆基因表達的因素有哪些？ 8. 什么是穿梭載體？ 9. 什么是基因轉(zhuǎn)染和基因轉(zhuǎn)染細胞？ 10. 原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點是什么？ 11. 雙脫氧末端終止法直接分析DNA一級結(jié)構(gòu)的基本原理是什么？ 12. RNA水平分析基因結(jié)構(gòu)的基本原理是什么？ 13. 什么是RNA酶保護試驗？ 14. 什么是核酸探針？怎樣進行核酸探針的標記？ 15. Southern印跡分析的基本過程是怎樣的？ 16. 常用的基因拷貝數(shù)的分析方法有哪些？
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| 下 次 課 預 習 要 點 | 1. Northern印跡的概念；Northern印跡分析的基本過程；實時RT-PCR的基本原理。 2. 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的概念。 3. 轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的基本過程；基因打靶的概念。 4. RNA干擾技術(shù)的概念；RNA干擾的基本原理；RNA干擾技術(shù)的基本流程。
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| 實 施 情 況 及 分 析 |
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| 基本內(nèi)容 | 教學手段 | 課堂設(shè)計和時間安排
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| 第十九章基因操作 （三) ――――――――――――――――― | （★－重點，☆－難點)
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| 第七節(jié) 基因表達的分析 Northern印跡定性分析基因的表達 ¢ 檢測對象：利用DNA探針檢測RNA樣品 ¢ 基本原理：DNA探針與RNA樣品變性復性，核酸分子雜交的堿基互補配對原理 ¢ 關(guān)鍵技術(shù)：RNA樣品的制備、電泳分離 ¢ 基本步驟：與Southern blot類似 ¢ 防止RNA降解：RNA酶抑制劑DEPC 處理 ¢ 應(yīng)用：定性和相對定量分析RNA | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)： Northern印跡的概念；Northern印跡分析的基本過程。(15分鐘)
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| RT-PCR定量分析基因的表達 | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)： RT-PCR定量分析基因表達的基本過程。(10分鐘)
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| 實時RT-PCR定量分析基因的表達 | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)： 實時RT-PCR定量分析基因表達的基本過程。(15分鐘)
――――第1節(jié)課結(jié)束―――
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| 第八節(jié) 基因功能的分析 轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于基因功能的研究 ¨ 轉(zhuǎn)基因技術(shù)：將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細胞的染色體上，使其在受體細胞中表達并發(fā)揮其功能的基因操作方法 1. 轉(zhuǎn)基因動物模型用于基因功能的研究 2. 基因轉(zhuǎn)染細胞模型用于基因功能的研究 ¨ 轉(zhuǎn)基因動物：應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育的攜帶外源基因的動物 ¨ 基本過程： -轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 -轉(zhuǎn)基因載體導入受精卵細胞或胚胎干細胞 -轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細胞植入假孕小鼠子宮 -轉(zhuǎn)基因動物的鑒定 ¨ 基因轉(zhuǎn)染細胞： -細胞水平上經(jīng)過轉(zhuǎn)基因操作獲得的細胞模型 ¨ 基本過程： -轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 -轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)染受體細胞 -轉(zhuǎn)基因細胞的鑒定，獲得表達外源基因的細胞株 ¨ 瞬時轉(zhuǎn)染 transient transfection 不對轉(zhuǎn)染細胞進行篩選，一般外源基因的表達及其對細胞的影響在48小時至72小時達到高峰，以后由于未接受基因轉(zhuǎn)染細胞的大量擴增，轉(zhuǎn)染細胞很快成為非優(yōu)勢生長而消失 ¨ 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 stable transfection 即對轉(zhuǎn)染細胞在壓力選擇（如加入抗生素)下培養(yǎng)，不含有導入基因的細胞在選擇中死亡，獲得了基因的細胞生存下來并成為穩(wěn)定表達外源基因的克隆細胞株 ¨ 可誘導表達 inducible expression 選擇含誘導型啟動子的表達載體，使外源基因在細胞內(nèi)保持關(guān)閉狀態(tài)，只有加入誘導劑后基因才開始表達，解決細胞毒性問題 | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的概念。瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (20分鐘) 轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的基本過程。 (20分鐘)
――――第2節(jié)課結(jié)束―――
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| 基因打靶技術(shù)用于基因功能的研究 1. 基因打靶：通過同源重組定向地從細胞染色 體上移除或移入特定基因的過程 ¨ 基因敲除KO：定向移除特定基因 ¨ 基因敲入KI：定向移入特定基因 2. 基因敲除: 體外重組（載體構(gòu)建)與體內(nèi)重組（同源重組)相結(jié)合的典型例子 ¨ 基因敲除小鼠：是最常用的基因敲除動物 ¨ 基本步驟： -載體構(gòu)建 -基因轉(zhuǎn)染 -植入小鼠子宮 -篩選獲得基因敲除動物 | 討論 簡圖 動畫 | ★☆結(jié)合圖示講解并強調(diào)：基因打靶的概念�；蚯贸夹g(shù)的基本原理。 (15分鐘)
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| RNA干擾技術(shù)用于基因功能的研究 1. RNA 干涉(RNA interference，RNAi) 指由短雙鏈RNA誘導的同源RNA降解的過程 2. RNAi技術(shù)： ¨ 指人工建立的利用體外合成或在細胞內(nèi)表達的短雙鏈RNA（21-23 nt)抑制細胞內(nèi)特定基因表達的技術(shù) ¨ 是機體的正常防御機制 3. RNAi技術(shù)的基本原理： ¨ 短雙鏈RNA （siRNA)，結(jié)合激活胞內(nèi)無活性或低活性的 Dicer酶復合物（核酸內(nèi)切酶和解旋酶等組成)， 形成RNA 誘導的沉默復合物（RISC),特異地切割 細胞內(nèi)的異常雙鏈RNA，產(chǎn)生短雙鏈RNA （siRNA)，通過此放大效應(yīng)清除靶RNA ¨ 短雙鏈RNA（siRNA)發(fā)揮著特異性識別和定位的重要作用 4. RNAi技術(shù)的基本流程： ¨ 流程： • 確定干擾靶點： AA（N19)TT、AA（N21) • 設(shè)計siRNA序列：3’端UU或dTdT單鏈 • 化學法合成siRNA或構(gòu)建siRNA表達載體 • siRNA的導入：目標RNA的含量檢測 ¨ 應(yīng)用： • 篩選藥物靶點：特異性和候選序列？ • 發(fā)展基于RNAi原理的藥物：口服？ | 討論 簡圖 動畫 | ★ ☆結(jié)合圖示和研究進展講解并強調(diào)：RNA干擾技術(shù)的概念(5分鐘) ★ RNA干擾的基本原理；(15分鐘) ★ RNA干擾技術(shù)的基本流程。 (5分鐘)
――――第3節(jié)課結(jié)束―――
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| 小 結(jié) | Northern印跡分析的基本過程；實時RT-PCR的基本原理。 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞。 轉(zhuǎn)基因動物和基因轉(zhuǎn)染細胞的基本過程。 RNA干擾的基本原理；RNA干擾技術(shù)的基本流程。 (5分鐘)
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| 復 習 思 考 題 、 作 業(yè) 題 | 1. 常用的RNA定性和定量分析方法有哪些？ 2. 實時PCR具有哪些特點？ 3. 蛋白質(zhì)水平上定性和定量分析基因表達的方法有哪些？ 4. 什么是轉(zhuǎn)基因技術(shù)？什么是轉(zhuǎn)基因動物？什么是基因轉(zhuǎn)染細胞？ 5. 轉(zhuǎn)基因的基本過程是怎樣的？ 6. 哪些技術(shù)方法可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的鑒定？ 7. 轉(zhuǎn)基因動物在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生物學領(lǐng)域有哪些方面的應(yīng)用？ 8. 什么是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞？ 9. 怎樣構(gòu)建打靶載體？ 10. 基因敲除的基本流程是怎樣的？ 11. RNA干擾基本原理是什么？
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| 下 次 課 預 習 要 點 | 1. 基因診斷的基本概念。 2. 用于連鎖分析的遺傳標志；基因缺失或插入的診斷；點突變的診斷。
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| 實 施 情 況 及 分 析 |
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