實習(xí)七、熒光光度法測定尿中的核黃素
（一)目的意義
尿中核黃素排出量測定是評價人體核黃素營養(yǎng)狀況的一種方法，包括負荷試驗和核黃素肌酐比值。
（二)原理
含有核黃素的溶液在紫外線下發(fā)黃綠色熒光，在稀溶液中熒光強度與核黃素濃度成正比。核黃素又可被低亞硫酸鈉還原而失去熒光，故測定還原前后的熒光強度可去除干擾性熒光物質(zhì)的影響。
（三)儀器和試劑
1．熒光光度計。
2．酸性水取濃硫酸0.3ml，加蒸餾水至200ml。
3．核黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備液 精確稱取25mg核黃素于1000ml容量瓶中，用酸性水稀釋至刻度，移至棕色瓶內(nèi)，冷藏備用。
4．核黃素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液 吸取上液4ml，用酸性水稀釋至100ml，臨用時配。
5．低亞硫酸鈉(Na2S204)。
（四)操作步驟
1．樣品 取尿樣1ml加酸性水19ml于一具塞試管內(nèi)，混勻，在激發(fā)波長420nm和發(fā)射波長530nm測定熒光強度。記下讀數(shù)(A)后，取10會計資格mg低亞硫酸鈉直接加入比色杯內(nèi)，搖勻，立即測定熒光強度并記下讀數(shù)(B)。
2．內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)取尿樣1ml加核黃素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液1.5ml，加酸性水17.5ml，混勻，在同樣條件下測定熒光強度，記下讀數(shù)(C)。
（五)計算
尿中核黃素含量(μg)= ×內(nèi)標(biāo)核黃素含量（μg)× 尿總量（ml)/分析用尿量（ml)
（六)說明
1．所有操作需在暗室內(nèi)進行。
2．做內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的目的是除去尿樣中可能存在的有熒光的物質(zhì)。
3．在使用熒光光度計醫(yī)學(xué)全.在線m.bhskgw.cn時需用熒光紅鈉校正。熒光紅鈉溶液的配制：溶解25.Omg熒光紅鈉(sodium fluorescein)于少量水中，攪拌使其溶解后加水至25Oml，此液為儲備液。取儲備液0.25ml加水稀釋至250ml，為工作液。校正步驟：先選擇所需激發(fā)波長和發(fā)射波長，校正儀器零點，然后以熒光紅鈉工作液校正光計使指針在某一刻度，在測定樣品的熒光強度。
4．如遇尿樣渾濁，難以直接讀數(shù)，可將尿液按上述方法稀釋后，過硅鎂層析再進行測定（見食品中核黃素測定)。
