實(shí)習(xí)六、食物及負(fù)荷尿中核黃素的測定
一、熒光法測定食物中的核黃素
（一)目的意義
核黃素是機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝中不可缺少的物質(zhì)。通過測定食物中核黃素含量，可了解人體核黃素?cái)z人情況。
(二)原理
核黃素受到波長為440～500nm的光照射后能產(chǎn)生光黃素，此物質(zhì)能產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光。在稀溶液中其熒光強(qiáng)度與核黃素濃度呈正比。
試液中再加入低亞硫酸鈉(Na2S204)，將核黃素還原為無熒光物質(zhì)，然后再測定試液中殘余熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，兩者之差即為食品中核黃素所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。
（三)儀器和試劑 &nbm.bhskgw.cn/wszg/sp;
1．熒光光度計(jì)。圖2核黃素吸附柱 Ib=內(nèi)徑寬度
2．高壓消毒鍋
3．錐形燒瓶、核黃素吸附柱（圖2)。
4. 1.0 mol/L鹽酸溶液 吸取分析純濃鹽酸83.3ml于1L容量瓶，加蒸餾水稀釋至刻度。
5. 0.1mol/L鹽酸溶液 吸上液100ml稀釋至1L。
6. 4%氫氧化鈉溶液，0.4%氫氧化鈉溶液。
7. 3%高錳酸鉀溶液。
8. 3%過氧化氫溶液。
9．核黃素儲備液(25 μg/ml) 精確稱取已干燥過的核黃素(在干燥器內(nèi)放置24h) 25mg，加少量蒸餾水溶解后倒入1L容量瓶，加蒸餾水500ml，加入2.4ml冰醋酸，將其放在溫水中搖動使顆粒完全溶解，冷卻后稀釋至刻度，加入少量甲苯，避光冷藏備用。
10．核黃素工作液(0.lyg/ml) 吸取上液10.Oml加水稀釋至250ml。避光，貯于4℃冰箱中可保存1周。
11. 20%低亞硫酸鈉溶液。用時(shí)現(xiàn)配，保存在冰水浴中，4h內(nèi)有效。
12. 0.04%溴甲酚綠指示劑 稱取O.lg溴甲酚綠于小研缽中，加1.4ml 0-4%
氫氧化鈉溶液研磨，加少許水，繼續(xù)研磨直至完全溶解，加水稀釋至250ml。
13. 2.5mol/L無水乙酸鈉溶液，使用時(shí)配制。
14. 10%木瓜蛋白酶2.5mol/L乙酸鈉溶液，使用時(shí)配制。
15. 10%淀粉酶2.5mol/L乙酸鈉溶液，使用時(shí)配制。
16．洗脫液 丙酮：冰乙酸：水(5：2：9)。
（四)操作步驟
整個(gè)操作過程需避光進(jìn)行。
1．樣品前處理 稱取2～10g樣品（約含10～200μg核黃素)于100ml錐形瓶中，加入50ml 0.1 mol/L鹽酸，攪拌到樣品顆粒分散均勻，置于高壓鍋內(nèi)，在6.8kg（15磅)高壓下水解樣品30min。水解液冷卻后，加入4%氫氧化鈉調(diào)pH至4.5（取少許水解液用0.04%溴甲酚綠檢驗(yàn)呈草綠色pH為4.5)。
2．酶解。
(1)含有淀粉的水解酶加入3ml10%淀粉酶溶液，于37～40℃保溫約16h。
(2)含高蛋白的水解液加3ml10%木瓜蛋白酶溶液，于37～40℃保溫約16h。
上述酶解液用水定容后至100ml，過濾。濾液在4℃冰箱可保存1周。
3．氧化去雜質(zhì) 取試管2支分別編號為A和B，按表3順序操作。
表3 氧化去雜質(zhì)操作
| 管號 | A | B |
| 濾液 | 10.0 | - |
| 核黃素工作液 | - | 1.0 |
| 蒸餾水 | 1.0 | - |
| 醫(yī)學(xué).全在線m.bhskgw.cn冰醋酸 | 1.0 | 1.0 |
| 混勻 | ||
| 3%高錳酸鉀液 | 0.5 | 0.5 |
混勻后放置2min以氧化樣品中雜質(zhì)與色素，再滴加3%過氧化氫至溶液褪色，以還原高錳酸鉀。劇烈搖動試管，使多余氧氣逸出。
4．核黃素的吸附和洗脫 吸附柱下端用一小團(tuán)脫脂棉墊上，然后稱取lg硅鎂吸附劑用濕法裝入柱子（約5cm高)。勿使柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡，調(diào)節(jié)流速為60滴/分鐘左右。將A管和B管內(nèi)的氧化后液體通過吸附柱后，用約20ml熱水洗脫樣液中的雜質(zhì)，再用5.Oml洗脫液將核黃素洗脫并收集于一帶蓋試管中，再用水洗吸附柱，收集洗出的液體并定容至10ml，混勻后待測熒光強(qiáng)度。
5．測定熒光強(qiáng)度選擇激發(fā)波長為420nm，發(fā)射波長為520nm，測量樣品管及標(biāo)準(zhǔn)管的熒光強(qiáng)度。然后，在各管的剩余液中加0.1ml20%低亞硫酸鈉溶液，立即混勻，在20s內(nèi)測出各管的熒光值，作為各自的空白值。
（五)計(jì)算
樣品中核黃素量
式中A:樣品管熒光值；
B:樣品管空白熒光值；
C:標(biāo)準(zhǔn)管熒光值； ‘
D:標(biāo)準(zhǔn)管空白熒光值；
F:稀釋倍數(shù)；
W:樣品重量g；
S：標(biāo)準(zhǔn)管中核黃素含量μg。
（六)．說明
1．加入低壓硫酸鈉量不能過多以免影響熒光強(qiáng)度，加入后必須立即讀數(shù)，否則核黃素又會被空氣氧化為熒光型。
2．過氧化氫不宜多加，因會產(chǎn)生氣泡而影響比色。
3．如加入高錳酸鉀后有氧化錳細(xì)微褐色溶液混濁，可離心使之澄清。
4．不能用皂粉洗滌玻璃器材，應(yīng)用硫酸-重鉻酸鉀洗液浸洗，再以清水洗凈。
