 |
 |
1 材料和方法
1.1 材料
30只健康成年豚鼠(體質(zhì)量300～400g，雌雄不拘)由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.50g L-1 心得安乳劑由西京醫(yī)院藥劑科配制.自行設(shè)計(jì)角蛋白K14，16，17探針，由北京奧科公司合成，原位雜交試劑盒購自博士德公司.
1.2 方法
①模型制備:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組20只，應(yīng)用50g L-1 心得安乳劑均勻外涂雙耳背皮膚，每日3次，連續(xù)涂4wk.對照組10只用單純?nèi)閯┩磕?4wk后取雙耳背部皮膚，一只耳用100mL L-1 甲醛溶液固定，另一只耳置于干燥瓶中，存放于-80℃低溫冰箱保存.②HE染色:將用100mL L-1 甲醛溶液固定的標(biāo)本脫水，透明浸蠟后包埋，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色.在光鏡下逐一觀察組織學(xué)所見.③原位雜交:置于干燥瓶中的組織經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟包埋后切片，厚度6μm，展開在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫水，30mL L-1 H 2 O2 室溫處理10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min×3次.滴加胃蛋白酶工作液，37℃消化10min，充分暴露mRNA，0.5mol L-1 PBS洗5min×3次，蒸餾水洗1次.每張切片上加20μL含標(biāo)記探針的原位雜交液，蓋上專用蓋玻片，置濕盒中37℃雜交過夜.同時(shí)設(shè)不加探針的空白對照.分別用30℃的2×SSC和0.2×SSC各洗滌5min×3次.滴加封閉液，室溫20min.滴加兔抗地高辛，37℃孵育1h，0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min，0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加SABC，7℃孵育30min，0.5mol L-1 PBS洗5min×4次.DAB顯色，蘇木素復(fù)染，充分水洗，然后乙醇脫水，二甲苯透明，封片醫(yī).學(xué).全.在.線m.bhskgw.cn.
2 結(jié)果
2.1 HE染色結(jié)果
正常對照組豚鼠皮膚可見菲薄的角質(zhì)層，顆粒層約為1～3層，棘細(xì)胞層約3～5層，基底層為單層柱狀細(xì)胞.真表皮交界較平，真皮內(nèi)有散在少數(shù)單核細(xì)胞浸潤(Fig1).實(shí)驗(yàn)組全部標(biāo)本共40份均可見到不同程度的棘層肥厚、表皮突延伸呈棒狀、真皮乳頭上伸杵狀變及毛細(xì)血管擴(kuò)張，36份標(biāo)本可見廣泛或局灶性的角化不全，顆粒層變薄或消失(Fig2).我們參考通用的Baker評分方法，對每份標(biāo)本逐一進(jìn)行組織學(xué)評分分析.應(yīng)用組織評分法(典型的銀屑病皮損評分在4.0～10.0之間)評分得到，40份涂藥組標(biāo)本組織學(xué)評分為7.6±0.6，20份正常對照組組織學(xué)評分為0.8±0.1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果差異顯著(P<0.01).
2.2 原位雜交結(jié)果
對正常豚鼠耳背部皮膚和銀屑病動(dòng)物模型皮損處組織的K14，16，17原位雜交結(jié)果顯示，正常皮膚中，在基底層細(xì)胞中見到K14的陽性雜交信號(hào)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色細(xì)小或粗大顆粒，但信號(hào)較弱，而K16和K17則未見到陽性信號(hào).在銀屑病樣皮損中，基底層及棘細(xì)胞層均有K14的高表達(dá)，在棘細(xì)胞層K16高表達(dá);而K17僅為低表達(dá)(Fig3～6).根據(jù)圖象掃描后的處理結(jié)果顯示，銀屑病模型動(dòng)物皮損處角蛋白K14及K16的表達(dá)較對照組顯著升高(K14P<0.05，K16P<0.01)，而K17的表達(dá)則無顯著性差異.
圖1 正常對照組HE染色(略)
Fig1 HE staining of normal control group ×200
圖2 實(shí)驗(yàn)組HE染色(略)
Fig2 HE staining of treated group ×200
圖3 正常對照組角蛋白K14原位雜交(略)
Fig3 Keratin14hybridization in situ of normal control group ×200
圖4 實(shí)驗(yàn)組角蛋白K14原位雜交(略)
Fig4 Keratin14hybridization in situ of treated group ×200
圖5 正常對照組角蛋白K16原位雜交(略)
