| 公開(公告)號(hào) | CN1300172C |
| 公開(公告)日 | 2007.02.14 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200310113790.6 |
| 申請(qǐng)日期 | 2003.11.25 |
| 專利名稱 | 一種抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體 |
| 主分類號(hào) | C07K16/10(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C07K16/10(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61K9/12(2006.01)I;A61K9/08(2006.01)I;A61K9/10(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;A61P11/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 王希良;杜新安;石辛甫;張松樂(lè);劉建源;李 巖;趙光宇;田 光;周 華 |
| 地址 | 100071北京市豐臺(tái)區(qū)東大街20號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 北京太兆天元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 張 韜 |
| 國(guó)省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種用于治療、預(yù)防及診斷SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗體，其特征在于該抗體是由如下制備方法制成的： 1)滅活純化的SARS-CoV加入不完全福氏佐劑乳化制備免疫原，采用皮下、肌肉、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)免疫經(jīng)檢疫符合生物制品要求的馬匹，免疫四次、間隔10天免疫一次，試血測(cè)抗體效價(jià)對(duì)流電泳1∶128、間接酶聯(lián)免疫1∶12800，測(cè)抗體中和效價(jià)細(xì)胞病變法1∶12800、空斑減數(shù)法1∶12800，并且不同的SARS-CoV標(biāo)準(zhǔn)毒株免疫馬產(chǎn)生的中和抗體均與其它SARS-CoV毒株呈現(xiàn)一致的中和抗體活性； 2)采集馬抗SARS-CoV血漿，用無(wú)熱源2倍蒸餾水稀釋加入21％飽和度硫酸銨混勻、離心棄沉淀纖維蛋白和白蛋白，上清再加入9％飽和度硫酸銨混勻離心要沉淀免疫球蛋白G，用無(wú)熱源蒸餾水恢復(fù)原體積再用30％飽和度硫酸銨混勻、離心要沉淀IgG，先加入一定量的無(wú)熱源蒸餾水、后加入無(wú)熱源0.9％氯化鈉鹽水用截留分子量為6萬(wàn)的超濾器超濾除鹽、濃縮和去雜蛋白，超濾液為純化的馬抗SARS-CoV IgG； 3)純化的馬抗SARS-CoV IgG用鹽酸調(diào)PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氫氧化鈉調(diào)PH至7.4，加熱58℃、30min，用帆布過(guò)濾去Fc段，濾液為初步純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體； 4)初步純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體過(guò)苯基疏水層析柱Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，用200mmol/L pH7.0磷酸緩沖液、1mol/L硫酸銨上柱，20mmol/L pH7.0磷酸緩沖液收集F(ab′)2抗體流出液，再用截留分子量為6萬(wàn)的超濾器超濾除鹽、濃縮，得純化的馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體； 其中滅活純化的SARS-CoV由如下方法制得： 1)綠猴腎細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)，取細(xì)胞種子庫(kù)凍存Vero細(xì)胞株，用DMEM培養(yǎng)基并加入10％小牛血清培養(yǎng)，提供培養(yǎng)SARS-CoV的Vero細(xì)胞； 2)SARS冠狀病毒滴定，對(duì)培養(yǎng)的Vero細(xì)胞加入經(jīng)鑒定凍存的SARS-CoV，擴(kuò)增培養(yǎng)SARS-CoV，采用組織培養(yǎng)測(cè)定SARS-CoV病毒的毒力，其半數(shù)感染量為106-108，對(duì)滴定的SARS-CoV分裝凍存； 3)用長(zhǎng)滿單層的Vero細(xì)胞加入滴定的SARS-CoV，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)SARS-CoV，生產(chǎn)SARS-CoV； 4)Vero細(xì)胞完全病變后收集SARS-CoV培養(yǎng)液，反復(fù)凍融三次，-37℃冰凍或不凍融，收集SARS-CoV細(xì)胞培養(yǎng)液； 5)向SARS-CoV培養(yǎng)液加入1/2000-1/8000的β-丙內(nèi)酯，4℃過(guò)夜、37℃2h滅活SARS-CoV，取滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液在Vero細(xì)胞上連傳三代，檢測(cè)SARS-CoV滅活效果； 6)滅活的SARS-CoV培養(yǎng)液，4℃、離心12000rpm 30min，棄沉淀雜蛋白，上清為SARS-CoV液； 7)用截留分子量為30萬(wàn)的超濾柱超濾SARS-CoV液，濃縮和去雜蛋白，濾液為粗制滅活的SARS-CoV； 8)對(duì)粗制滅活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子篩柱，開始緩沖液是0.1MPBS PH7.0緩沖液，用100mM PBS PH7.0洗脫，收集SARS-CoV，合并濃縮收集初步純化的SARS-CoV； 9)對(duì)初步純化的SARS-CoV液上DE52陰離子柱層析，用100mM PB，PH7.2液平衡并將病毒吸附在柱上、用100mM PB，PH7.2，0.35M NaCl洗脫，收集SARS-CoV峰，合并濃縮收集純化的SARS-CoV； 10)純化滅活的SARS-CoV分裝放-70℃保存。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種用于治療、預(yù)防及診斷SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體，特征在于該抗體為馬抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗體，同時(shí)本發(fā)明公開該抗體的制備方法。本發(fā)明抗體能特異消滅SARS-CoV，對(duì)非典型肺炎的治療和預(yù)防有很好的效果。 |
| 國(guó)際公布 |
