| 公開(公告)號(hào) | CN1249243C |
| 公開(公告)日 | 2006.04.05 |
| 申請(專利)號(hào) | CN200310114614.4 |
| 申請日期 | 2003.12.18 |
| 專利名稱 | 靶向肝癌AFP基因的siRNAs表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與用途 |
| 主分類號(hào) | C12N15/63(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/63(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 濟(jì)南市中心醫(yī)院 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 汪運(yùn)山;亓同鋼 |
| 地址 | 250013山東省濟(jì)南市解放路105號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體，其特征是，以pSilencer3.0-H1為載體，由H1啟動(dòng)子啟動(dòng)針對AFP基因的發(fā)夾狀雙鏈RNA分子的表達(dá)，本載體質(zhì)粒針對AFP基因編碼區(qū)序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′，是用于與AFP相關(guān)的肝細(xì)胞癌的治療性物質(zhì)，由以下方法制得： (1)RNA干涉靶序列的選擇及插入模板的設(shè)計(jì)與合成 選擇AFP基因編碼區(qū)序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′，設(shè)計(jì)并合成了兩段互補(bǔ)的寡核苷酸序列，序列如下： 5’-gatcccgctcagtgaggacaaactatttcaagagaatagtttgtcctcactgagttttttggaaa-3’， 5’-agcttttccaa-aaaactcagtgaggacaaactattctcttgaaatagtttgtcctcactgagcgg-3’； (2)將上述合成的兩段寡核苷酸與線性化的Psilencer3.0-H1的連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及質(zhì)粒的純化 首先將合成的兩段寡核苷酸等量混合，90℃3min，37℃孵育1h，然后將結(jié)合的雙鏈寡核苷酸與帶有BamH1和HindIII粘性末端的Psilencer3.0-H1質(zhì)粒連接，，最后，將連接成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌，經(jīng)氨芐青霉素篩選，挑選耐藥菌落大量培養(yǎng)，質(zhì)粒的提取及純化采用經(jīng)典的堿裂解法和聚乙二醇質(zhì)粒純化法； (3)質(zhì)粒的鑒定 DNA瓊脂糖凝膠電泳，及應(yīng)用M13的通用測序引物進(jìn)行測序，以確定合成的寡核苷酸是否已經(jīng)轉(zhuǎn)入pSilencer3.0-H1質(zhì)粒中及是否有堿基異常存在。 |
| 摘要 | 靶向肝癌AFP基因的siRNAs表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與用途，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。以pSilencer3.0-H1為載體，由H1啟動(dòng)子啟動(dòng)針對AFP基因的發(fā)夾狀雙鏈RNA分子的表達(dá)，本載體質(zhì)粒針對AFP基因編碼區(qū)序列5′-AACTCAGTGAGGACAAACTAT-3′，是用于與AFP相關(guān)的肝細(xì)胞癌的治療性物質(zhì)。靶向AFP基因的siRNAs表達(dá)載體用于制備分泌AFP蛋白的肝癌的基因治療藥物。 |
| 國際公布 |
