一種芯片原位聚合酶鏈反應(yīng)檢測目標基因的方法
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公開(公告)號
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CN1291037C
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公開(公告)日
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2006.12.20
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申請(專利)號
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CN200410016012.X
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申請日期
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2004.01.19
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專利名稱
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一種芯片原位聚合酶鏈反應(yīng)檢測目標基因的方法
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主分類號
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C12Q1/68(2006.01)I
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分類號
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C12Q1/68(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所
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發(fā)明(設(shè)計)人
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趙建龍;高秀麗;楊劍波;景奉香
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地址
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200050上海市長寧區(qū)長寧路865號
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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上海智信專利代理有限公司
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代理人
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潘振甦
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國省代碼
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上海;31
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主權(quán)項
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一種利用原位PCR檢測芯片檢測目標基因的方法，其特征在于檢測的具體步驟是：(1)引物設(shè)計：遵循各個引物的退火溫度Tm值大致相同的原則，用Primer5.0軟件設(shè)計引物，序列如下┏━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━┓┃ 引物名稱┃ 上游引物 ┃ 下游引物 ┃ 產(chǎn)物長度┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ GUS ┃ 5′-聚(T)16GGT CAG TGG CAG TGA ┃ 5′-AGC GTC GCA GAA CAT ┃ 539bp ┃┃ ┃ AGG G-3′Tm＝58.1 ┃ TAC AT -3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝55.8 ┃ ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ 35S ┃ 5′-聚(T)16TGG AAA AGG AAG GTG ┃ 5′-ATA GTG GGA TTG TGC ┃ 209bp ┃┃ ┃ GCTC-3′Tm＝57.3 ┃ GTC AT-3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝55 ┃ ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ HptII ┃ 5′-聚(T)16GAT GTT GGC GAC CTC ┃ 5′-TCG TTA TGT TTA TCG ┃ 517bp ┃┃ ┃ GTA TT-3′Tm＝57.5 ┃ GCA CTT T-3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝57.4 ┃ ┃┣━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━┫┃ AadA ┃ 5′-聚(T)16GTT GCT GTC TCC CAG ┃ 5′-CCT TTG CTC GGA AGA ┃ 298bp ┃┃ ┃ GTC GG-3′Tm＝62.5 ┃ GTA TGAA -3′ ┃ ┃┃ ┃ ┃ Tm＝59.1 ┃ ┃┗━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━┛(2)芯片的制備：上游引物5’端氨基修飾且連有16個堿基長的多聚T的臂結(jié)構(gòu)，將上游引物用去離子水溶解并與點樣緩沖液等體積混合，通過Cartesian microarray制作系統(tǒng)點陣于醛基修飾載玻片表面，室溫下固定72h；(3)芯片上的原位PCR反應(yīng)：PCR擴增體系如下┏━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━┓┃ 試劑 ┃ 每份用量 ┃┣━━━━━━━━━━━━━━╋━━━━━━━┫┃ 10×buffer ┃ 1.5ul ┃┃ 濃度為2.5mM的dNTP ┃ 1.2ul ┃┃ dig-dUTP ┃ 0.5ul ┃┃ 濃度為15ng/ul的模版 ┃ 1.5ul ┃┃ 濃度為10pmol/ul的反向引物 ┃ 1ul×4 ┃┃ 濃度為1U/ul的Taq ┃ 1ul ┃┃ H2O ┃ 5.3ul ┃┃ 總體積 ┃ 15ul ┃┗━━━━━━━━━━━━━━┻━━━━━━━┛取PCR混合液50ul滴于芯片方陣上，然后用蓋片封片，置于PCR儀上采用如下程序進行循環(huán)：94℃預(yù)變性4分鐘，94℃變性1分鐘-58℃退火1分鐘-72℃延伸30秒，共10個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘；(4)芯片的洗脫及顯色PCR結(jié)束后，去除蓋片后置于0.1×SSC0.1％SDS洗液I中室溫搖洗10-30分鐘，然后在含有100mM順丁烯二酸、150mM NaCl PH7.5、0.3v/v％吐溫20的洗液II中搖洗5分鐘，吸干洗液后于方陣上滴加15-20ul抗體，蓋上蓋玻片后避光室溫反應(yīng)30分鐘；最后經(jīng)洗液II、檢測緩沖液沖洗、吸干后，滴加顯色液并蓋膜使其顯色于膜上，室溫避光顯色30分鐘-2小時。
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摘要
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一種利用基因芯片的檢測方法，是在芯片表面進行原位PCR反應(yīng)對待測基因進行檢測的方法。將普通PCR反應(yīng)中的上游引物連接poly(T)的臂結(jié)構(gòu)后，5’端氨基修飾后連接于醛基修飾的玻片等載體上，在芯片表面上進行的一種芯片原位PCR反應(yīng)。利用本發(fā)明能有效解決目前基因芯片雜交中小片斷探針和待測大片段不能有效雜交的問題，實現(xiàn)了樣品處理和標記同步化和原位檢測。本發(fā)明可用于SNP檢測、轉(zhuǎn)基因植物檢測、疾病檢測等方面。
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國際公布
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