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公開(公告)號
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CN1250737C
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公開(公告)日
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2006.04.12
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申請(專利)號
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CN200310106227.6
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申請日期
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2003.11.07
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專利名稱
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含CpG DNA畜禽疫苗佐劑的PCR制備方法
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主分類號
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C12P19/34(2006.01)I
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分類號
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C12P19/34(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;A61K39/39(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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深圳市未來海洋科技發(fā)展有限公司
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發(fā)明(設(shè)計)人
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朱鴻飛;李光富
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地址
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210096廣東省深圳市中心區(qū)福中一路江蘇大廈30樓45號信箱
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司
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代理人
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王之梓
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國省代碼
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廣東;44
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主權(quán)項
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一種能提高畜禽疫苗效價的含CpGDNA畜禽疫苗佐劑的PCR制備方法，其特征在于：第一步：該基因工程重組質(zhì)粒是按如下步驟制備的，按照5’-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3’、5’-GGTGCGTCGATGCAGGGGGG-3’及5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’串聯(lián)而成的目的DNA序列，合成其正鏈和負(fù)鏈，在合成的寡核苷酸末端加上能與線形載體末端相匹配的堿基序列，然后將如此得到的寡核苷酸片段、退火緩沖液及無菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中孵浴3分鐘以上，自然冷卻至室溫，將由此形成的一個或多個這樣的雙鏈DNA片段插入線性載體的相應(yīng)的酶切位點，最后，將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌而得到的基因工程重組質(zhì)粒。第二步：根據(jù)目的片段兩端的重組質(zhì)粒DNA序列，設(shè)計特異引物。第三步：以重組質(zhì)粒為模板，加入特異引物，并進(jìn)行三溫循環(huán)的PCR擴增，具體參數(shù)為：92℃～98℃預(yù)變性5～10分鐘；92℃～98℃，45～60秒，50～58℃，45～60秒，72℃，45～60秒，進(jìn)行30～35個循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘。
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摘要
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含CpG DNA畜禽疫苗佐劑的PCR制備方法，據(jù)由序列為：5’-GGTGCATCGATGCAGGGGGG-3’、5’-GGTGCGTCGATGCAGGGGGG-3’及5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’串聯(lián)而成的D19D282006 DNA片段的序列，合成其正鏈和負(fù)鏈，在合成的寡核苷酸末端加能與載體末端匹配的堿基，將此寡核苷酸片段、退火緩沖液、無菌重蒸水混合后，于90℃～100℃水浴中3分鐘以上，冷卻至室溫，形成含CpG基序的目的片段，將DNA片段插入載體相應(yīng)的酶切位點，并將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌得到重組質(zhì)粒；據(jù)目的片段兩端的重組質(zhì)粒DNA序列，設(shè)計特異引物；以重組質(zhì)粒為模板，加入特異引物，進(jìn)行三溫循環(huán)PCR擴增，具體參數(shù)為：92℃～98℃預(yù)變性5～10分鐘；92℃～98℃，45～60秒，50～58℃，45～60秒，72℃，45～60秒，進(jìn)行30～35個循環(huán)；最后在72℃延伸10分鐘。
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國際公布
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