動脈粥樣硬化:第四節(jié)　載脂蛋白CⅢ基因型檢測

載脂蛋白CⅢ基因位于11號染色體與載脂蛋白AⅠ-AⅣ形成一基因族，它位于載脂蛋白AⅠ下游，有三個內含子和四個外顯子。目前對載脂蛋白CⅢ基因3"末端非編碼區(qū)C-G對換產(chǎn)生一個Sac-Ⅰ酶切位點與冠心病的關系未有定論。用多聚酶鏈反應（PCR)擴增載脂蛋白CⅢ基因3"末端233bp，再用Sac-1酶切擴增產(chǎn)物，可以檢測載脂蛋白CⅢ基因3"末端的突變及其與動脈粥樣硬化相關性。本節(jié)采用PCR-RFLP檢測ApoCⅢ基因型。

一、儀器與試劑

1．儀器：電泳儀，基因擴增儀。

2．試劑：TaqDNA聚合酶，dNTP，DNA參考物，Sca-1酶。

二、操作方法

1.模DNA提取

取用EDTA抗凝全血100μl加試劑(0.32mol/L蔗糖，5mmol/l MgCl₂,1%TritonX-100,0.01mol/L Tris-HClpH7.6)，振搖至溶解均勻透明，3000r/min離心10min,棄上清，沉淀部分加0.9NaCl溶液洗一次，加預冷試劑Ⅱ(75mmol/l NaCl,24mmol/L EDTA)100μl，20%SDS15μl，蛋白酶K10μl（6g/L)于65℃水浴4h，加200μl酚和氯仿：異戊醇（24：1)各提兩次，上清加無水乙醇1.0ml放置于-20℃2h，以12kr/min離心5min，真空干燥后加50μlTE緩沖液溶解，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．多聚酶鏈反應

Primer1：5"-GTGACC GAT GGC TTC AGT TCC CTG-3"，primer2:5"-GGt AGG AGAGCA CTC AGA ATA CA-3"。反應總體積為50μl，擴增緩沖液所含物質終濃度為：Tris-HCl，pH8.3，67mmol/L；MgCl₂25mmol/L；KCl 50mmol/L；明膠0.01%，dNTP各0.2～0.5μmol/L，模板約10μg，加40μl液體石蠟，94℃預變性4min，加Tag聚合酶1.5U，以93℃1min、65℃1.5min、72℃1.5min，循環(huán)30次。

3．擴增產(chǎn)物酶切

取擴增產(chǎn)物20μl加入NH₄AC20μl，再加300μl無水乙m.bhskgw.cn醇混均置-20℃1h，10000r/min離心7min棄上清，干燥后加Sac-1酶液10μl37℃保溫2h。

4.擴增產(chǎn)物堿基對分m.bhskgw.cn/zhicheng/子量測定

采用GB公司產(chǎn)DNamarker,以已知DNA片段bp數(shù)相對應的電泳遷移距離，取半對數(shù)作圖制成標準曲線，再根據(jù)等測定擴增產(chǎn)物DNA片段移動距離在標準曲線上求出其bp數(shù)。

三、結果分析

采用本節(jié)設計引物擴增產(chǎn)物為ApoCⅢ基因3"非編碼區(qū)233bp，該產(chǎn)物經(jīng)Sac-1酶切可出現(xiàn)三種結果；①酶切后仍為一條帶，電泳遷移率未發(fā)生改變，為S₁S₁純合子；②酶切后除原始帶外又增加了兩條帶，查標準DNa marker曲線在158bp和75bp相同，為S₂S₂雜合子；③酶切后原始帶消失，出現(xiàn)兩條新帶，其電泳遷移率與158bp和75bp相同，為S₂S₂純合子。S₂為擴增的基因產(chǎn)物中C-G對換增加一個酶切位點。

檢查100名正常人中有S₂雜合子28名，純合子2名；68名冠心病人中S₂雜合16名，純合子4名，它們的頻率變化見表（19-4)。S₂基因頻率兩組間無明顯差別。

表19-4 載脂蛋白CⅢ基因Sac-Ⅰ酶切頻率表

X=0.079,p＞0.05(兩組比較)

（徐瓊)