動脈粥樣硬化:第四節(jié)　血清脂蛋白非電泳定量法

一、高密度脂蛋白膽固醇測定

血漿中脂蛋白有多種，測定其各自的含量對于了解機體正常及疾病過程中脂質代謝狀況有重要的臨床意義。HDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，其膽固醇含量占血漿總膽固醇量的25%～35%。由于血漿中所有脂蛋白均含有膽固醇，因此，只有先分離出HDL才能對其進行定量。分離HDL的方法中，沉淀法是目前臨床使用最多的方法，操作簡便快速。沉淀法原理是利用多聚陰離子和二價陽離子共同作用于脂蛋白，并選擇性地使含ApoB的VLDL和LDL脂蛋白沉淀，再測定含HDL的上清液膽固醇，即高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C)。定量HDL全量是很困難的，因為它是蛋白質和脂類的混合物，故以測定HDL中所含膽固醇含量作為HDL定量依據(jù)。

要測定血清中HDL-C，就必需先沉淀HDL以外的脂蛋白，即VLDL和LDL。使血清中VLDL和LDL沉淀的試劑很多，常用的有四種：①肝素-錳沉淀法，該法操作簡便易行，一旦遇上血脂升高的標本，有沉淀不完全的差異；②硫酸葡聚糖-鎂法，該法也簡單易行，試劑較貴而難買到；③聚乙二醇法，雖然簡便易行，若遇高脂血癥標本，其重復性差；④磷鉬鎢酸-鎂法，操作簡便易行，結果準確，是目前臨床推薦使用的方法；⑤另有一種不沉淀VLDL和LDL也可直接測定HDL的方法，稱之為直接測定法。其原理是，先用一種封阻血清VLDL和LDL，而不封阻HDL，當測膽固醇的酶試劑加入后，酶可作用于HDL的膽固醇進行化學反應，測出其濃度，但酶試劑就無法使已被試劑封阻的VLDL和LDL的膽固醇進行反應，這種直接法操作更為簡便，無需離心等繁雜步驟，便于在自動生化分析儀上進行HDL-C測定，結果準確可靠，缺點是成本過高。下面僅介紹目前推薦使用的方法。

（一)原理

磷鎢酸-鎂（PTA-Mg²⁺)沉淀血清中含ApoB的脂蛋白（VLDL、LDL)，上清液中只含HDL，用酶法測定上清液中膽固醇，即HDL-C。

生成的醌亞胺與HDL中的CE及FC成正比。

2．試劑組成

（1)沉淀劑磷鎢酸鈉4g溶于50ml雙蒸水中，加入1mol/l NaoH16ml，充分攪拌后，再加雙水至100ml，調pH到7.6。再取40ml此溶液，加2mol/l MgCl₂10ml，混勻，再加水至100ml，此為應用液。

（2)膽固醇酶法測定試劑（同第十五章)

（3)膽固醇標準參考液（同第十五章)

3．操作

（1)空腹12h，抽取靜脈血，不抗凝，分離血清備測。于24h內操作完畢。

（2)其他操作同前。

4．注意事項

（1)室溫以15～20℃為宜，＜15℃或＞30℃時應增加或減少靜置時間，離心轉速要恒定一致。

（2)離心沉淀后，要立即吸出上清進行測定，否則結果偏離不準。

（3)若血清TC超過500mg/dl時，上清液會出現(xiàn)混濁，表明有部分膽蛋白漂浮在上清液中未沉淀完全，此時將血清稀釋重新沉淀，其所測值乘以稀釋倍數(shù)。

（二)血清HDL-C選擇遮敝直接測定法。

1．原理

含反應抑制劑的陰離子表面活性劑加入血清中后，與CM、VLDL和LDL緊密結合，少量與HDL結合。爾后，再加入反應促進劑的聚陰離子表面活性劑后，HDL溶化并釋放出膽固醇，與膽固醇測定試劑進行反應，達到僅測出高密度脂蛋白-膽固醇（HDL-C)的目的，其反應全過程為：

2．試劑（第一化學)

RⅠ：前處理液（第一反應液)

RⅡ：第二反應液（可溶性表面活性劑)及顯色液

HDL-C參考血清

3．操作

按雙試劑雙波長法在CL-7200型全自動生化分析儀進行檢測，有關參數(shù)如表16-1所示。

表16-1 HDL-C檢測參數(shù)

標本濃度按△A=A₂-A₁的吸光度計算

4．特點

（1)直接測定，無需預處理。

（2)操作簡便，減少影響準確性的因素。

（3)標本及試劑用量少，準確性高。

（4)抗干擾能力強，適合于自動化分析。

（5)該法CV為5%以下，回收率90%～110%。線性范圍（0～5.85mmol/L)。

5．注意事項

（1)待測血清標本于當日測試，2～8℃保存，一周內測定，-20℃長期保存，對測定結果無影響。

（2)干擾物維生素C500mg/L、膽紅素200mg/L、Hb5.0g/L以下均不影響測定結果。

二、血清低密度脂蛋白測定

LDL是一組不均一的脂蛋白顆粒，其膽固醇含量約占總膽固醇的45%～50%。

測定血漿中LDL，首先同樣要分離LDL，其分離方法有超速離心法、聚陰離子沉淀法、色譜法、電泳法及計算法等。以聚陰離子沉淀法簡便易于操作，結果準確可靠。由于直接測定LDL有一定的困難，因為它是蛋白質脂類組成的顆狀結構，膽固醇是其較為衡定的因素，因此采用測定LDL中所含的膽固醇的濃度作為LDL定量的依據(jù)。

另外，還可以通過用Friedwal公式計算，主要是利用血清TC、TG及HDL-C濃度測定結果，即LDL-C=TC-HDL-C-（1/5)TG。對脂代謝異常的高脂血癥，不能按此方法計算結果。

（一)聚乙烯硫酸鹽（PVS)法

1．原理

生成的醌亞胺與上清液的TC含量成正比。

2．試劑組成

（1)沉淀劑：聚乙烯硫酸鉀鹽0.7g/L、聚乙二醇獨甲醚170g/L、乙二胺四乙酸5mmol/L，混勻，4～21℃避光可保存一年。

（2)酶法膽固醇測定試劑（同第15章)。

（3)膽固醇標準液：2.58mmol/L。

3．操作

（1)空腹12h，采靜脈血，3h內分離完成血清以免脂蛋白之間相互交換和防止LDL降解。-70℃可以保存數(shù)月之久。

（2)取200μl血清置于含有沉淀劑100μl試管中充分混勻，室溫放置15min,3000r/min離心，留上清測定膽固醇。

（3)按下表進行操作：

混勻，37℃6min，以空白管調零（500nm)，讀取光密度。

（4)計算

血清LDL-C=TC-上清液膽固醇

（5)注意事項

標本沉淀過程嚴格按要求進行。吸取上清液時，注意輕吸，別攪動沉淀。

PVS法能將Lp（α)完全沉淀，一般情況下，正常人含量極少，一旦高脂血癥、Lp（α)增高時，其測定值LDL-C應為LDL-C和Lp（α)-C之和。

（二)血清LDL-C直接測定法

1．原理

含反應活性劑的試劑Ⅰ加入血清后，與HDL、VLDL和CM反應，使其膽固醇水解并與酶反應生成無色產物溶于介質中。再加入含溶解LDL的活性劑Ⅱ試劑，使LDL水解并與其中的膽固醇試劑進行偶聯(lián)反應生成紅色化合物，定量血清中LDL-C。

以△A=A₂-A₁進行運算，測出LDL-C的含量

2．試劑（第一化學)

R1：去垢劑1、COD、POD、4-AAP。

R2：去垢劑2、DSBmT。

3．操作

按CL-7200型或其他型號全自動生化分析儀檢測，有關參數(shù)如表16-2所示。

表16-2　LDL-C檢測參數(shù)

4．特點

（1)直接測定，無需預先處理。

（2)操作簡便，減少影響準確性的因素。

（3)標本及試劑用量少，準確性高。

（4)抗干擾能力強，適合于自動化分析。

（5)該法CV為5%以下，回收率90%～110%，線性范圍0～88mmol/L。

5．注意事項

待測血清標本于當日測試，2～8℃一周內保存，-20℃以下長期保存，結果均不受影響。

三、高密度脂蛋白亞組份膽固醇（HDL2-C，HDL3-C)檢測

聚乙二醇20000沉淀法

1．原理：

HDL中主要組份為HDL₂和HDL₃。用聚乙二醇20000（PEG20000)作沉淀劑，以不同濃度在不同pH條件下，可將HDL₂和HDL₃分離開。95g/L聚乙二醇20000在pH6.5環(huán)境下可將血清中低密度脂蛋白（LDL)和極低密度脂蛋白（VLDL)沉淀，離心后上清液中只含HDL。170g/L聚乙二醇20000在pH7.5環(huán)境中，可將LDL、VLDL、HDL₂沉淀，離心后上清液中只含HDL₃，以酶試劑側定各自上清液中膽固醇含量，通過換算，計算出代表HDL各亞組分含量。

2．試劑：沉淀劑Ⅰ：95g/L PEGm.bhskgw.cn/shiti/20000，pH6.5

沉淀劑Ⅱ：170g/LPEG20000，pH7.5。

膽固醇酶應用液及參考血清以試劑盒而定。

3．操作方法：（以生化分析儀為例)按表16-3操作

表16-3 HDL-C亞組分測定操作步驟

置混勻器上混勻2min，置室溫10min，3000r/min離心20min，上清液待測。

上清液于生化分析儀測定，測定參數(shù)參照總固醇測定法。

5．結果計算

HDL-C=上機測得結果×血清稀釋倍數(shù)

HDL₃-C=上機測得結果×血清稀釋倍數(shù)

HDL₂-C=HDL-C×HDL3

6．注意事項：

離心時間及速度一定要準確；

離心上清液混濁者應繼續(xù)離心直到清亮止；

四、血清Lp（α)測定法

1．原理

血漿（清)中脂蛋白（α)（Lp（α))與Lp（α)的單克隆抗體（鼠)結合形成抗原抗體免疫復合物，有濁度改變，測定溶液界質中混濁度的光密度改變，求其血漿中Lp（α)的含量。

Lp（α)+抗人Lp（α)→抗原抗體復合物→測定光密度

2．試劑與儀器

試劑（第一化學)；Lp（α)緩沖液（R1)；Lp（α)抗體液（R2)。

儀器：生化分析儀（以CL-7200型為例)

3．操作方法

以△A=A₂-A₁進行運算Lp（α)濃度。

4．定標：

取Lp（α)定值液，用0.9%NaCl液稀釋。

采用上述操作步驟，按免疫測定法定標，其操作方法及標準曲線如圖16-3所示。

圖16-3 Lp（α)免疫測定法的反應過程光密度變化值mAbs（A)及其檢測的標準曲線圖（B)（CL-7200型)

上機參數(shù)（以CL-72OO型為例)

5．注意事項：

（1)操作時，標本和試劑無需處理；

（2)血漿或血清標本均可檢測。標本置2～21℃保存1周不變；

（3)標本濃度超過定標最高值時，應用生理水稀釋后再測；

（4)抗體試劑（R₁)避免反復接觸；

（5)測定時避免日光直接照射。

五、脂蛋白x的電泳分析

1．原理

血清脂蛋白x的組成中磷脂占66%，蛋白質僅占6%，在電場中因電荷少，選擇電滲大小合適的瓊脂為電泳支持物，則LpX向陰極移動，而其他蛋白質向陰極移動，從而達到分離的目的。用免疫沉淀法或聚陰離子沉淀法使其在瓊脂板上沉淀，對于LpX陽性的血清可以在加樣孔的陰極端見到白色沉淀帶。

2、試劑

巴比妥緩沖液500mmol/L：pH8.6,離子強度0.05。

1%瓊脂用上述巴比妥緩沖液加熱配制。

沉淀劑；每升中含MgCl₂0.1mol，肝素2.5g及MaCl9g。

3．儀器：電泳儀。

4．操作：

（1)制板 1%瓊脂糖加熱未冷卻前于一潔凈載玻片上均勻鋪開。凝固后在一端2cm～3cm處打孔（直徑約2.5mm)。

（2)電泳　將血清20μl加于小孔內（勿使外溢和有氣泡)。按瓊脂糖脂蛋白電泳操作、搭橋、通電1mA、40min。

（3)漿瓊脂玻片浸在沉淀劑中30min后觀察結果（如Lp-x陽性，數(shù)min內即出現(xiàn)沉淀線)，Lp-x濃度到3.3mg/dl上即可出現(xiàn)陽性反應。

正常值：正常人血清無Lp-x帶。

（儲建中　吳翠華)