生物化學(xué)與分子生物學(xué):第一節(jié)　轉(zhuǎn)錄作用

RNA的轉(zhuǎn)錄合成從化學(xué)角度來(lái)講類(lèi)似于DNA的復(fù)制，多核苷酸鏈的合成都是以5’→3’的方向，在3’-OH末端與加入的核苷酸磷酸二酯鍵，但是，由于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的目的不同，轉(zhuǎn)錄又具有其特點(diǎn)：（1)對(duì)于一個(gè)基因組來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因，而且每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄都受到相對(duì)獨(dú)立的控制（圖17-2)；（2)轉(zhuǎn)錄是不對(duì)稱(chēng)的。（3)轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續(xù)的。

一、依賴(lài)DNA的RNA聚合酶

真核和原核細(xì)胞內(nèi)都存在有DDRP，迄今發(fā)現(xiàn)的DDRP的有以下特點(diǎn)：①以DNA為模板；在DNA的兩條多苷酸鏈中只有其中一條鏈作為模板，這條鏈叫做模板鏈（templatestrand)，又叫做無(wú)意義鏈。DNA雙鏈中另一條不做為模板的鏈叫做編碼鏈，又叫做有意義鏈，編碼鏈的的序列與轉(zhuǎn)錄本RNA的序列相同，只是在編碼鏈上的T在轉(zhuǎn)錄本RNA為U，由于RNA的轉(zhuǎn)錄合成是以DNA的一條鏈為模板而進(jìn)行的，所以這種轉(zhuǎn)錄方式又叫做不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)錄。②都以四種三磷酸核苷的底物，原料；③都遵循DNA與RNA之間的堿基配對(duì)原由，A=U，T=A，C=G，合成與模板DNA序列互補(bǔ)的RNA鏈。④RNA鏈的延長(zhǎng)方向是5’→3’的連續(xù)合成。⑤需要Mg2+或Mn2+離子。⑥并不需要引物。RNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，所以沒(méi)有校正功能。

圖17－2　細(xì)菌染色體上幾個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的方向及所用模板

RNA聚合酶催化下列反應(yīng)：

大腸桿菌RNA聚合酶的研究得比較透徹的，這是一個(gè)分子量達(dá)50多萬(wàn)，全酶由五咱亞基組成，去掉δ亞基的部分稱(chēng)為核心酶，核心酶本身就能催化苷酸間磷酸二酸鍵形成。利福平和利福霉素能結(jié)合在β亞基上而對(duì)此酶發(fā)生強(qiáng)烈的抑制作用。β亞基似乎是酶和核苷酸底物結(jié)合的部位。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄是在DNA特定的起始點(diǎn)上開(kāi)始的，δ亞基的功能是辨認(rèn)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的。β’亞基是酶與DNA模板結(jié)合的主要成分。α亞基可能與轉(zhuǎn)錄基因的類(lèi)型和種類(lèi)有關(guān)。

表17-1 大腸桿菌RNA聚合酶

真核生物中已發(fā)現(xiàn)有四種RNA聚合酶，分別稱(chēng)為RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和線(xiàn)粒體RNA聚合酶，分子量大致都在50萬(wàn)道爾頓左右，它們專(zhuān)一性地轉(zhuǎn)錄不同的基因，因此由它們催化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也各不相同。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最顯著，它位于核仁中，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄編碼rRNA的基因。而細(xì)胞內(nèi)絕大部分RNA是rRNA是RNA。RNA聚合酶Ⅱ，位于核質(zhì)中，負(fù)責(zé)核內(nèi)不勻一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前體。RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)合成tRNA和許多小的核內(nèi)RNAs。鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶特異性抑制劑，三種真核生物RNA聚合酶對(duì)鵝膏蕈堿的反應(yīng)不同，見(jiàn)表17-2，原核生物靠RNA聚合酶就可完成從起始、延長(zhǎng)、終止的轉(zhuǎn)錄全過(guò)程，真核生物轉(zhuǎn)錄除RNA聚合酶外還需另一此叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子參與轉(zhuǎn)錄的全過(guò)程，見(jiàn)后敘。

表17-2 真核生物的RNA聚合酶

二、RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程

轉(zhuǎn)錄的主要過(guò)程見(jiàn)圖17-3，為研究和敘述方便，可將RNA合成分為識(shí)別與起始、延長(zhǎng)和終止三個(gè)階段。

圖17-3　轉(zhuǎn)錄的主要過(guò)程

（一)識(shí)別

轉(zhuǎn)錄是從DNA分子的特定部位開(kāi)始的，這個(gè)部位也是RNA聚合酶全酶結(jié)合的部信這就是啟動(dòng)子。為什么RNA聚合酶能夠僅在啟動(dòng)子處結(jié)合呢？顯然啟動(dòng)子處的核苷酸序列具有特殊性，為了方便，人們將在DNA上開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基定為+1，沿轉(zhuǎn)錄方向順流而下的核苷酸序列均用正值表示；逆流而上的核苷酸序列均用負(fù)值表示。

對(duì)原核行物的100多個(gè)啟動(dòng)子的序列進(jìn)行了比較后發(fā)現(xiàn)；在RNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游大約-10bp和-35bp處有兩個(gè)保守的序列，在-10bp附近，有一組5’-TATAATpu的序列，這是Pribnow首先發(fā)現(xiàn)的稱(chēng)為Pribnow框，RNA聚合酶就結(jié)合在互部位上。-35bp附近，有一組5’-TTGACG-的序列；已被證實(shí)與轉(zhuǎn)錄起始的辨認(rèn)有關(guān)，是RNA聚合酶中的δ亞基識(shí)別并結(jié)合的位置。-35序列的重要性還在于在很大程度上決定了啟動(dòng)子的強(qiáng)度。

由于RNA聚合酶分子很大，大約能覆蓋70bp的DNA序列，因此酶分子上的一個(gè)適合部位就能占據(jù)從-35到-10序列區(qū)域（圖17-4)。

圖17-4　Structure of the prokaryotic promoter region.

真核生物的啟動(dòng)子有其特殊性，真核生物有三種RNA聚合酶，每一咱都有自己的啟動(dòng)子類(lèi)型。以RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)為例，人們比較了上百個(gè)真核生物RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子核苷酸序列伯發(fā)現(xiàn)；在-25區(qū)有TATA框，又稱(chēng)為Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列為T(mén)28A97A93A85A63T37A83A50T37，基本上都由A，T堿基所組成，離體轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)表明，TATA框決定了轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的選擇，天然缺少TATA框的基本可以從一個(gè)以上的位點(diǎn)開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。在-75區(qū)有CAAT框，其一致的序列為GGTCAATCT。有實(shí)驗(yàn)表明CAAT框與轉(zhuǎn)錄起始頻率有關(guān)，例如缺失GG，兔子的β珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄效率只有原來(lái)的12%（圖17-5)。

圖17-5　Eukaryotic gene promoter sequences

除啟動(dòng)子外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游處還有一個(gè)稱(chēng)為增強(qiáng)子的序列，它能極大地增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，它的位置往往不固定，可存在于啟動(dòng)子上游或下游，對(duì)啟動(dòng)子來(lái)說(shuō)它們正向排列和反向排列均有效，對(duì)異源的基因也起到增強(qiáng)作用，但許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)它仍可能具有組織特異性，例如免疫球蛋白基因的增強(qiáng)子只有在B淋巴細(xì)胞內(nèi)活性最高，胰島素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增喲子也都有很高的組織的特異性。

（二)轉(zhuǎn)錄起始和延伸

在原核生物中，當(dāng)RNA聚合酶的δ亞基發(fā)現(xiàn)其識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，全酶就與啟動(dòng)子的-35區(qū)序列結(jié)合形成一個(gè)封閉的啟動(dòng)子復(fù)合物。由于全酶分子較大，其另一端可在到-10區(qū)的序列，在某種作用下，整個(gè)酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，在此處發(fā)生局部DNA12-17r 的解鏈形成全酶和啟動(dòng)子的開(kāi)放性復(fù)合物。在開(kāi)放性啟動(dòng)子復(fù)合物中起始位點(diǎn)和延長(zhǎng)位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體充滿(mǎn)，在RNA聚合酶β亞基催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酸鍵。RNA合成的第一個(gè)核苷酸總有GTP或ATP，以GTP常見(jiàn)，此時(shí)δ因子從全酶解離下來(lái)，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動(dòng)，而脫落的δ因子與另一個(gè)核心酶結(jié)合成全酶反復(fù)利用。

圖17－6　轉(zhuǎn)當(dāng)起始復(fù)合物的模式

真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，已經(jīng)知道，在所有的細(xì)胞中有一類(lèi)叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。

真核生物基因中，有專(zhuān)門(mén)為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可大致分為二類(lèi)；第一類(lèi)為普遍轉(zhuǎn)錄因子它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置上開(kāi)始。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有至成一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子ⅡD。TFⅡD再與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。（圖17-6)

除TFⅡD以外，在細(xì)胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用，像TFⅡH就有旋轉(zhuǎn)酶活性，它可利用ATP分解產(chǎn)生的能量，介導(dǎo)起始點(diǎn)雙螺旋的打開(kāi)，使RNA聚合酶得以發(fā)揮作用。從中也不難看出真核細(xì)m.bhskgw.cn/zhicheng/胞中基因轉(zhuǎn)錄的起始是基因的表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵，這么多蛋白質(zhì)分子之間相互作用，以及這些蛋白質(zhì)分子DNA調(diào)控?zé)o件相結(jié)合，構(gòu)成控制基因轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的復(fù)雜體系。

第二類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或者叫可誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，這此TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類(lèi)固醇激素，生長(zhǎng)因子或其它刺激后，開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)，才需要的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。

例如：激活劑蛋白-1就是一類(lèi)可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，它是由多蛋白質(zhì)成份組成的復(fù)合物，可發(fā)由fos基因和jun基因家庭的蛋白質(zhì)產(chǎn)物組成。當(dāng)某些生長(zhǎng)因子細(xì)胞因子和某些化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞外刺激這些細(xì)胞時(shí)，使細(xì)胞內(nèi)JUN蛋白和FOS蛋白發(fā)生磷酸化，特異地結(jié)合到c-jun基因和c-fos基因的啟動(dòng)子部位，使這些基因轉(zhuǎn)錄并翻譯出相應(yīng)的c-JUN蛋白和c-FOS蛋白，這些蛋白質(zhì)就可組成二聚體的AP-1，AP-1就會(huì)結(jié)合到細(xì)胞核中靶基因的調(diào)控部位，促進(jìn)或激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，產(chǎn)生出由于細(xì)胞外刺激因素作用下，這些細(xì)胞做出的特異反應(yīng)一表達(dá)出的特異蛋白須分子。有關(guān)詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)錄一章。

RNA鏈的延長(zhǎng)靠核心酶的催化，在起始復(fù)合物上第一個(gè)GTP的核糖3’-OH上與DNA模板能配對(duì)的第二個(gè)三磷酸核苷起反應(yīng)形成磷酸二酯鍵。聚合進(jìn)去的核苷酸又有核糖3’-OH游離，這樣就可按模板DNA的指引，一個(gè)接一個(gè)地延長(zhǎng)下去。因此RNA鏈的合成方面也是5’--3。由于DNA鏈與合成的RNA鏈具有反平行關(guān)系，所以RNA聚合酶是沿著DNA鏈3’--5’方向移動(dòng)。整個(gè)轉(zhuǎn)錄過(guò)程是由同一個(gè)RNA聚合酶來(lái)完成的一個(gè)連續(xù)下斷的反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄本RNA生成后，暫時(shí)與DNA模板鏈形成DNA·RNA雜交體，長(zhǎng)度約為12個(gè)堿基對(duì)，形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄泡（圖17-7)。轉(zhuǎn)錄速度大允是每秒鐘30-50個(gè)核苷酸，但并不是以恒定速度進(jìn)行的。在電子顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，可以看到同一DNA模板上，有長(zhǎng)短不一的新合成的RNA鏈散開(kāi)成羽毛狀圖形，這說(shuō)明在同一DNA基因上可以有很鑫的RNA聚合酶在同時(shí)催化轉(zhuǎn)錄，生成相應(yīng)的RNA鏈。而且較長(zhǎng)的RNA鏈上已看到核糖體附著，形成多聚核糖體。說(shuō)明某些情況下，轉(zhuǎn)錄過(guò)程未完全終止，即已開(kāi)始進(jìn)行翻譯。

圖17-7　Diagrammatic representation of DNA transcription by E.coli RNApolymerase.The polym.bhskgw.cn/job/merase unwinds a stretch of DNA about 17base pairs in lengthforming a transcriptional bubble thatprogresses along thd DNA.The DNA has tounwind ahead of the polymerase and rewind behind it .The newly formed RNA formsa RNA-DNA double helix about 12 bae pairs long.

轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)階段，原核生物與真核生物之間沒(méi)有太大差別。

（三)轉(zhuǎn)錄的終止（Termination)

轉(zhuǎn)錄是在DNA模板某一位置上停止的，人們比較了若干原核生物RNA轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)附近的DNA序列，發(fā)現(xiàn)DNA模板上的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)有兩種情況，一類(lèi)是不依賴(lài)于蛋白質(zhì)因子而實(shí)現(xiàn)的終止作用，另一類(lèi)是依賴(lài)蛋白質(zhì)輔因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用，這種蛋白質(zhì)輔因子稱(chēng)為釋放因子，通常又稱(chēng)ρ因子。兩類(lèi)終止信號(hào)有共同的序列特征，在轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文結(jié)構(gòu)，回文序列是一段方向相反，堿基互補(bǔ)的序列，在這段互補(bǔ)序列之間由幾個(gè)堿基隔開(kāi)，不依賴(lài)ρ因子的終止序列中富含G·C堿基對(duì)，其下游6-8個(gè)A；而依賴(lài)ρ因子的終止序列中G·C堿基對(duì)含量較少，其少游也沒(méi)有因固定的特征，其轉(zhuǎn)錄生成的RNA可形成二級(jí)結(jié)構(gòu)即柄一嚕噗結(jié)構(gòu)，又稱(chēng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能與RNA聚合酶某種特定的空間結(jié)構(gòu)相嵌合，阻礙了RNA聚合酶進(jìn)一步發(fā)揮作用（圖17-8)。除DNA模板本身的終止信號(hào)外，在入噬菌體中，發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)有協(xié)助RNA聚合酶跨越終止部位的作用，叫做抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白，例如入噬菌體的N基因產(chǎn)物。

圖17-8　原核生物轉(zhuǎn)錄作用的終止信號(hào)

真核生物由于RNA轉(zhuǎn)錄后很快就進(jìn)行了加工，因此很難確定原初轉(zhuǎn)錄物的3’末端。病毒SV40的終止位點(diǎn)經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，很像大腸桿菌的不依賴(lài)ρ因子的終止子，轉(zhuǎn)錄后的RNA可形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3’末端帶有一連串的U。爪蟾5sRNA的3’末端有4個(gè)U，它們前后的序列為富含G·C的序列，這是所有真核生物RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)。這種序列特征高度保守，從酵母到人都很相似，任何改變這種序列特征的突變都將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止位置的改變。