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中國(guó)生物制品規(guī)程:短棒狀桿菌菌苗制造及檢定規(guī)程

本品系用具有免疫調(diào)節(jié)及抑瘤等活性的厭氧棒狀桿菌經(jīng)培養(yǎng)后制成懸液,加甲醛殺菌,以無(wú)菌緩沖生理鹽水稀釋而成。用于惡性腫瘤及其他疾病的免疫治療。1 菌種1.1 菌種來(lái)源制造菌苗用的菌種采用厭氧短棒狀桿菌H75010或其他經(jīng)試驗(yàn)證明安全有效的菌株。生產(chǎn)用菌種和檢定用血…

本品系用具有免疫調(diào)節(jié)及抑瘤等活性的厭氧棒狀桿菌經(jīng)培養(yǎng)后制成懸液,加甲醛殺菌,以無(wú)菌緩沖生理鹽水稀釋而成。用于惡性腫瘤及其他疾病的免疫治療。

1 菌種

1.1 菌種來(lái)源

制造菌苗用的菌種采用厭氧短棒狀桿菌H75010或其他經(jīng)試驗(yàn)證明安全有效的菌株。生產(chǎn)用菌種和檢定用血清,由中國(guó)藥品生物制品檢定所分發(fā)或經(jīng)同意。

1.2 菌種檢定

1.2.1 培養(yǎng)特性

檢定菌種用碎肉半流體、肝硫乙醇酸鈉培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。本菌應(yīng)為革蘭氏陽(yáng)性短棒狀菌,有異染顆粒。

1.2.2 生化反應(yīng)

應(yīng)發(fā)酵葡萄糖,不發(fā)酵棉子糖、麥芽糖、蔗糖,液化明膠,靛基質(zhì)、硝酸鹽反應(yīng)陽(yáng)性。

1.2.3 血清學(xué)試驗(yàn)

應(yīng)屬Ⅰ型。Ⅰ型血清由中國(guó)藥品生物制品檢定所供應(yīng)或經(jīng)同意。

1.2.4 脾激活試驗(yàn)

用體重18~20g純種小白鼠(C3H、615或C57BL),試驗(yàn)及對(duì)照各10只,雌雄各半。試驗(yàn)組每只腹腔注射菌液0.5ml(15億菌),對(duì)照組注射同量生理鹽水,14天處死小白鼠,分別稱(chēng)體重、脾重、計(jì)算脾指數(shù),其指數(shù)應(yīng)不低于2.0。

脾指數(shù)=試驗(yàn)組脾重(mg)/總體重(g)÷對(duì)照組總脾重(mg)/總體重(g)

1.2.5 抑瘤試驗(yàn)(艾氏腹水癌)

用體重18~20g純種小白鼠(C3H、615、C57BL或K-LACA),試驗(yàn)及對(duì)照組各10只。雌雄各半,每只腹腔注射活的瘤細(xì)胞100萬(wàn)/0.2ml(用傳代5~8天非血性腹水)。試驗(yàn)組于注射瘤細(xì)胞前1天及攻瘤后次日起,連續(xù)腹腔注射菌液0.25ml(15億)3~5次,每次間隔1天,對(duì)照組同時(shí)注射同量生理鹽水,由對(duì)照組小白鼠全部因癌性腹水死亡起點(diǎn)計(jì)算試驗(yàn)組小白鼠存活率,觀察期最長(zhǎng)30天,其存活率應(yīng)不低于70%。

1.2.6 毒性試驗(yàn)

小白鼠及分組要求同1.2.4項(xiàng),稱(chēng)總體重,試驗(yàn)組每只小白鼠腹腔注射0.5ml菌液(15億),對(duì)照組注射同量生理鹽水,觀察1周,到期稱(chēng)總體重,不得較試驗(yàn)前減輕或死亡。

1.3 菌種保存

菌種應(yīng)凍干,置2~8℃保存。

2 菌苗制造

2.1 制造用培養(yǎng)基

可用蛋白胨、肝或酵母透析液培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基。

2.2 原液制造

2.2.1 接種

連續(xù)2~4次傳代的種子液接種于大瓶或培養(yǎng)罐,36~37℃厭氧培養(yǎng)4~6天。

2.2.2 采集

到期之培養(yǎng)物采集前逐瓶或逐罐鏡檢,有雜菌污染者廢棄。

2.2.3 殺菌

采集之菌體加入不超過(guò)0.5%(ml/ml)甲醛溶液,殺菌48小時(shí)后進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn),不得有任何菌生長(zhǎng)。

2.2.4 菌液洗滌

無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液經(jīng)離心沉淀后,用新鮮無(wú)菌生理鹽水洗滌3次,其最后一次用無(wú)菌生理鹽水做成懸液,加溫60~65℃1小時(shí),逐瓶做無(wú)菌試驗(yàn),合格后合并。

2.2.5 原液合并

無(wú)菌試驗(yàn)合格的菌液合并成批,放2~8℃保存。

2.3 原液檢定

2.3.1 鏡檢

菌形正常,至少觀察10個(gè)視野,應(yīng)無(wú)雜菌。

2.3.2 無(wú)菌試驗(yàn)

按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

2.3.3 濃度測(cè)定

按中國(guó)細(xì)菌濁度標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定。

2.3.4 毒性試驗(yàn)

按1.2.6項(xiàng)進(jìn)行。

2.3.5 脾激活試驗(yàn)

除脾指數(shù)應(yīng)不低于1.5個(gè),余同1.2.4項(xiàng)。

2.3.6 抑瘤試驗(yàn)

同1.2.5項(xiàng)。樣品應(yīng)先按2.m.bhskgw.cn/job/6項(xiàng)加溫處理。

2.4 菌液稀釋

2.4.1 稀釋

根據(jù)2.www.med126.com3.3項(xiàng)測(cè)定的原液濃度用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液生理鹽水(pH7.2~7.4)稀釋成每ml含菌體60億±的菌苗。

2.4.2 分批

同一天由同一批原液稀釋的菌苗作為1批,如1批有數(shù)瓶,應(yīng)分亞批。

2.4.3 檢定

稀釋的菌苗應(yīng)逐瓶做無(wú)菌試驗(yàn)。

2.5 分裝

經(jīng)2.4.3項(xiàng)檢定合格的菌苗在充分搖勻下分裝。

2.6 加熱處理

分裝安瓿后立即60℃±2℃加熱30分鐘。

3 成品檢定

3.1 理化檢定

菌苗應(yīng)為乳白色懸液,pH6.6~7.2,無(wú)異味,無(wú)搖不散的菌塊及異物。

甲醛含量不得超過(guò)0.006%(ml/ml)。

3.2 無(wú)菌試驗(yàn)

按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

3.3 脾激活試驗(yàn)

按2.3.5項(xiàng)進(jìn)行

3.4 抑瘤試驗(yàn)

按1.2.5項(xiàng)進(jìn)行(檢定合格的原液在半年內(nèi)分裝者,成品可不再作3.3~3.5項(xiàng)檢定)。

3. 5 濃度測(cè)定

按2.3.3項(xiàng)測(cè)定,每ml應(yīng)含菌體60億±10%。

3.6 安全試驗(yàn)

用18~20g白小鼠5只,每只皮下注射菌苗0.5ml,觀察7日,不得有局部膿腫或死亡。

4 保存與效期

應(yīng)保存于2~8℃。自原液采集之日起效期為2年半。

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