| 公開(公告)號 | CN1693480A |
| 公開(公告)日 | 2005.11.09 |
| 申請(專利)號 | CN200510049601.2 |
| 申請日期 | 2005.04.20 |
| 專利名稱 | 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測人21號染色體數(shù)目的方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 呂時(shí)銘;朱宇寧;裘 儉;朱 波;尤建飛 |
| 地址 | 310006浙江省杭州市學(xué)士路2號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 張法高;趙杭麗 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 檢測人21號染色體數(shù)目的方法，其特征是：通過應(yīng)用基因組特異性單拷貝序列作為染色體的分子標(biāo)記，在21號染色體的唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域選擇DSCR4基因的部分非多態(tài)性片段為目標(biāo)分子標(biāo)記，在1號染色體上不易發(fā)生缺失或三體的區(qū)域選擇RABIF基因的部分片段為內(nèi)參分子標(biāo)記，分別設(shè)計(jì)兩對引物及相應(yīng)的Taqman探針，采用多重實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對目標(biāo)分子標(biāo)記和內(nèi)參分子標(biāo)記進(jìn)行同管擴(kuò)增，通過deltact值來確定21號染色體數(shù)目并由此診斷21三體綜合征，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：(1)選擇染色體的分子標(biāo)記21號染色體上的目標(biāo)分子標(biāo)記為GTTGATGGGCTTGCGCTTATCTGCTTGTCCCTTCTCCCATCTGATTTCTTGTGGAGCCCATGG其中上游引物序列：5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列：5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探針序列：5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1號染色體上的內(nèi)參分子標(biāo)記為TCAACATGGGCCCCACATGGTCCTAGTTTCCCCGGCTCATTATGCTTCAGGCACACTGGCTTTCTTGC其中上游引物序列：5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列：5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探針序列：5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’(2)標(biāo)本制備取新鮮EDTA抗凝全血或羊水，采用QIAampDNABloodMiniKit提取DNA，用紫外分光光度計(jì)檢測DNA純度及濃度；(3)多重實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增采用ABIPrism7000型熒光定量PCR儀同管擴(kuò)增目標(biāo)分子標(biāo)記及內(nèi)參分子標(biāo)記，反應(yīng)體系25μl，含基因組500-25000拷貝，加入兩對引物各500nM，相應(yīng)Taqman探針200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM，反應(yīng)條件為95℃5分鐘預(yù)變性；95℃30秒，60℃30秒，兩步法40個(gè)循環(huán)；(4)定量分析采用ABIPrism7000型熒光定量PCR儀隨機(jī)附帶軟件進(jìn)行定量分析，分析體系設(shè)置為0.14，基線范圍起點(diǎn)為第6個(gè)循環(huán)，終點(diǎn)為同板反應(yīng)最小ct值的前1-3個(gè)循環(huán)，軟件自動(dòng)輸出各擴(kuò)增片段的ct值，計(jì)算deltact值，根據(jù)不同的deltact范圍來判斷21號染色體數(shù)目。 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供檢測人21號染色體數(shù)目的方法，是應(yīng)用基因組特異性單拷貝序列作為染色體的分子標(biāo)記，在21號染色體的唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)域選擇DSCR4基因的部分非多態(tài)性片段為目標(biāo)分子標(biāo)記，在1號染色體上不易發(fā)生缺失或三體的區(qū)域選擇RABIF基因的部分片段為內(nèi)參分子標(biāo)記。設(shè)計(jì)兩對引物及相應(yīng)的Taqman探針，采用多重實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)同管擴(kuò)增這兩個(gè)序列，通過反映相對量的delta ct值來確定21號染色體的數(shù)目并由此診斷21三體綜合征。本發(fā)明將染色體的數(shù)目分析轉(zhuǎn)化為分子信號檢測，充分利用分子定量的優(yōu)勢，不僅方法簡便、高度敏感、穩(wěn)定和檢測率高，而且還具有高通量和自動(dòng)化的特點(diǎn)，在臨床有極好的應(yīng)用前景。 |
| 國際公布 |
